| 研究課題/領域番号 |
62480154
|
|---|
| 研究機関 | 徳島大学 |
|---|
研究代表者 |
大西 克成 徳島大学, 医学部, 教授 (10037400)
|
|---|
| 研究分担者 |
木内 武美 徳島大学, 医学部, 助手 (80136217)
小野 恒子 徳島大学, 医学部, 助手 (40035514)
秋本 茂 徳島大学, 医学部, 講師 (10159337)
|
|---|
| キーワード | 偏性嫌気性菌 / バクテロイデス / 病原性 / 遺伝子クローニング / neruaminidase / エレクトロポレーション / 組換え体選択ベクター |
|---|
| 研究概要 |
1.コスミドベクダーpHC79を使用してBacteroides fragilis YCH46株のneuraminidase遺伝子(nanH^+)を大腸菌HB101tol^-株にクローン化した。そのnanH^+の組換えプラミドpOT2633のDNAは約46Kbであり、約39KbのB.fragilis由来のDNAを保有していた。pOT2633保有株のneuraminidaseはHB101tolH^-株(遺伝子産物をペリプラズムから菌体外へ放出しやすい変異株)では40%が、HB101株では1%が培養液中に放出されていた。pOT2633を制限酵素Sal Iで切断後、セルフライゲーションによりnanH^+のサブクローシpOT3001(17Kb)を得た。今後はさらにサブクローニングを続け、DNA塩基配列を決定する予定である。また遺伝子産物を精製して、そのアミノ酸配列の一部を決定し、DNA塩基配列より得られた結果と一致するかどうかを調べる予定である。
2.上の例のように、Bacteroidesの遺伝子を大腸菌にクローン化しても、その遺伝子発現が著しく低い場合が少なくないので、遺伝子をBacteroidesに再伝達してその活性が上昇するかどうかを調べる必要がある。我々はエレクトロポレーションによって、シャトルベクターpVALー1(11Kb)をBacteroides thetaiotaomicron5482株に伝達できることを明らかにした。伝達効率は、電場強度10kv/cmにおいて4.0×10^4/μgDNAであった。またMg^<2+>やCa^<2+>(各10mM)存在下では伝達効率は約1/10に低下した。以上の結果はB.thetaiotaomicron5482株より調製したプラスミドでは、B.thetaiotaomicron5482株を形質転換することができなかった。
3.致死遺伝子pndを利用して、組換え体を保有する大腸菌のみが生育できるような(すなわち正の選択が可能な)ベクターpUCST5を作製した。
|
