金属酵素活性中心による一酸化窒素還元反応の高速分子動画撮影

2022 年度 実績報告書

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 22H04760
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (00548993)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 時間分解構造解析 / 一酸化窒素 / 金属酵素 / ヘム / 反応中間体 / ケージド化合物

研究実績の概要

膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄および非ヘム鉄からなる複核活性中心において、細胞毒である一酸化窒素（NO）の還元反応を触媒する。NORによるNO還元の化学についての理解を深めるために、本課題では、X線自由電子レーザー（XFEL）を利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応中間体の構造を明らかにすることを目的としている。これまでの溶液試料を用いた実験から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解計測が可能であることを示してきており、本課題では、これを結晶試料に適用する。NORによるNO還元反応は、還元型NORとNOが反応することで開始されるので、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐ必要がある。つまり、NORの反応を時間分解構造解析により追跡するためには、嫌気条件下での時間分解X線構造解析を行う必要がある。そのために、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを提案し、本測定に適した酸素バリア性フィルムを入手し、酸素バリア性フィルムを結晶化プレートとして、NORの結晶を得る方法を確立してきた。
本年度は、上述の酸素バリア性フィルムを用いて得られた結晶のＸ線回折実験をXFEL施設SACLAにて実施した。測定では、結晶を含んだフィルム状プレートを適当な大きさに切り取り、海外研究協力者であるDiamond Light Sourceのグループが開発した固定ターゲット測定用のホルダに固定した。そして、ラスタ―スキャンを行うことで、回折像を取得した。得られた回折像について指数付けを行ったところ、NORの結晶の空間群・格子定数を示しており、回折像が取得できていることが確認できた。しかし、この実験では、得られた回折像が少なすぎたため、構造解析には至らなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2020-2021年度の研究を通じて確立した酸素バリア性フィルムをフィルム状結晶化プレートとして利用した方法で得られたNORの結晶について、SACLAでの測定が可能か検討した。結晶が得られたフィルムプレートを適当な大きさに切り取り、海外研究協力者が開発した固定多ゲット型測定用のホルダに固定した。これをラスタースキャンによりXFEL光の照射位置を変えながらＸ線回折実験を行ったところ、フィルムによる高いバックグラウンドの中、回折斑点を観測することができた。得られた回折像について、指数付けを行ったところ、SPring-8で得られている空間群・格子定数と同様の結果を得ることができ、SACLAでもデータ収集が可能であることが示唆された。しかし、今回の実験では、得られた回折像が少なく、構造決定には至らなかった。
時間分解計測では、還元型NORの調製が必要となるので、還元型の結晶の調製を試みた。これまで還元型の試料を調製し、結晶化に取り組んできたが、良質な結晶を得ることができなかったので、酸化型の結晶を還元剤で還元することとした。酸化型の結晶をメッシュループで掬い取り、ジチオナイトを含んだ結晶化母液に浸した後、結晶を凍結し、SPring-8のマイクロフォーカスビームラインにて、結晶の質を検討した。X線回折実験の結果、ジチオナイト溶液に浸漬した結晶においても、分解能2.5 A程度の回折データを得ることができた。この結果は、還元作業を行っても結晶が大きな損傷を受けないことを示している。
以上のように、NORの高速分子動画撮影に向けた準備が進められている。

今後の研究の推進方策

グローブボックス内で酸化型のNOR結晶をジチオナイトで還元し、還元剤を含まない結晶化母液で洗浄した後にケージドNOを浸潤させる。これを酸素バリア性フィルムで包み込み、グローブボックスから取り出す。フィルムを適当なサイズに切断し、SACLAでの固定ターゲット型測定用ホルダに固定し、ラスタースキャンによる測定を行う。この際には、光励起によるケージドNOの光解離を利用した時間分解X線結晶構造解析を行い、NORによるNO還元反応についての高速分子動画撮影を行う。
室温での高速分子動画撮影と並行して、反応中間体を凍結捕捉し、無損傷構造解析による構造決定にも取り組む。溶液を用いた実験では、還元型NORとケージドNOを混合した試料を凍結し、液体窒素温度での紫外光照射を行った後に、温度を170 Kまで昇温すると、非ヘム鉄にNOが結合した化学種が得られることをつきとめている。この手法は、結晶試料にも適用可能なので、還元型NORの結晶をケージドNOを含んだ結晶化母液に浸漬したものを凍結する。その後、紫外光照射を行い、温度を170 Kに昇温することで、反応中間体を結晶中で捕捉できるものと期待できる。溶液での実験では、更なる昇温で、別の化学種が形成している可能性を示すデータが得られており、昇温温度を変えていくことで、NORによるNO還元反応の動画撮影を目指す。

研究成果

• [国際共同研究] Diamond Light Source/University of Liverpool/University of Essex(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Diamond Light Source/University of Liverpool/University of Essex
  • 他の機関数: 3
• [雑誌論文] Trapping of a Mononitrosyl Nonheme Intermediate of Nitric Oxide Reductase by Cryo-Photolysis of Caged Nitric Oxide (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeda Hanae、Shimba Kanji、Horitani Masaki、Kimura Tetsunari、Nomura Takashi、Kubo Minoru、Shiro Yoshitsugu、Tosha Takehiko
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 127 ページ: 846～854
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c05852
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for heme detoxification by an ATP-binding cassette-type efflux pump in gram-positive pathogenic bacteria (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Hiro、Hisano Tamao、Rahman Md. Mahfuzur、Tosha Takehiko、Shirouzu Mikako、Shiro Yoshitsugu
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 ページ: -
  • DOI: 10.1073/pnas.2123385119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single crystal spectroscopy and multiple structures from one crystal (MSOX) define catalysis in copper nitrite reductases (2022)
  • 著者名/発表者名: Rose Samuel L.、Baba Seiki、Okumura Hideo、Antonyuk Svetlana V.、Sasaki Daisuke、Hedison Tobias M.、Shanmugam Muralidharan、Heyes Derren J.、Scrutton Nigel S.、Kumasaka Takashi、Tosha Takehiko、Eady Robert R.、Yamamoto Masaki、Hasnain S. Samar
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 ページ: -
  • DOI: 10.1073/pnas.2205664119
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Complementarity of neutron, XFEL and synchrotron crystallography for defining the structures of metalloenzymes at room temperature (2022)
  • 著者名/発表者名: Moreno-Chicano, Carey, Axford, Beale, Doak, Duyvesteyn, Ebrahim, Henning, Monteiro, Myles, Owada, Sherrell, Straw, Srajer, Sugimoto, Tono, Tosha T., Tews, Trebbin, Strange, Weiss, Worrall, Meilleur, Owen, Ghiladi, Hough
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 9 ページ: 610～624
  • DOI: 10.1107/S2052252522006418
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Serial Femtosecond Crystallography Reveals the Role of Water in the One- or Two-Electron Redox Chemistry of Compound I in the Catalytic Cycle of the B-Type Dye-Decolorizing Peroxidase DtpB (2022)
  • 著者名/発表者名: Lucic Marina、Wilson Michael T.、Tosha Takehiko、Sugimoto Hiroshi、Shilova Anastasya、Axford Danny、Owen Robin L.、Hough Michael A.、Worrall Jonathan A. R.
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 12 ページ: 13349～13359
  • DOI: 10.1021/acscatal.2c03754
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identifying antibiotics based on structural differences in the conserved allostery from mitochondrial heme-copper oxidases (2022)
  • 著者名/発表者名: Nishida, Yanagisawa, Morita, Shigematsu, Shinzawa-Itoh, Yuki, Ogasawara, Shimuta, Iwamoto, Nakabayashi, Matsumura, Kato, Gopalasingam, Nagao, Qaqorh, Takahashi, Yamazaki, Kamiya, Harada, Mizuno, Takahashi, Akeda, Ohnishi, Ishii, Kumasaka, Murata, Muramoto, Tosha T., Shiro, Honma, Shigeta, Kubo, Takashima, Shintani.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34771-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] NO reduction chemistry at heme/non-heme binuclear active center proved by methods using photo-sensitive caged NO (2022)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Mechanism of biological nitric oxide reduction proved by time-resolved structural analysis (2022)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: REDOX WEEK IN SENDAI 2022, 4th International conference on persulfide and sulfur metabolism in biology and medicine
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Elucidation of Mechanisms for Catalytic Reaction of Nitric Oxide Reductases by Time-resolved Techniques (2022)
  • 著者名/発表者名: T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro, M. Kubo
  • 学会等名: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP)-12
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光解離性基質の低温光解離を利用した金属酵素短寿命反応中間体の同定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第61回電子スピンサイエンス学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を用いた金属酵素反応機構の解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: メタルバイオサイエンス研究会2022
  • 招待講演
• [学会発表] 酸素バリア性フィルムを利用した嫌気下での構造解析の試み (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、榛葉幹治、松浦滉明、平田邦生、山本雅貴、城宜嗣
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 金属酵素活性中心における一酸化窒素還元反応の分子機構 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 物性研短期研究会「理論タンパク質物性科学の最前線：理論と実験との密な協働」
  • 招待講演
• [学会発表] 各種分光計測を駆使した鉄活性中心における一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • 招待講演
• [備考] 反応途中の酵素を観る新手法の開発
  • URL: https://www.riken.jp/press/2023/20230111_2/index.html