金属酵素活性中心による一酸化窒素還元反応の高速分子動画撮影

2023 年度 実績報告書

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 22H04760
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 當舎 武彦 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (00548993)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 時間分解構造解析 / 金属酵素 / ヘム / 一酸化窒素 / ケージド化合物 / 反応中間体

研究実績の概要

膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄および非ヘム鉄からなる複核活性中心において、細胞毒である一酸化窒素（NO）の還元反応を触媒する。NORによるNO還元の化学についての理解を深めるために、本課題では、X線自由電子レーザー（XFEL）を利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応中間体の構造を明らかにすることを目的としている。溶液試料を用いた実験から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解分光計測が可能であることを示してきており、本課題では、これを結晶試料に適用する。NORによるNO還元反応は、還元型NORとNOが反応することで開始されるので、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐ必要がある。つまり、嫌気条件下での時間分解X線構造解析が必要となる。そのために、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを提案し、酸素バリア性フィルムを結晶化プレートとして、NORの結晶を得る方法を確立してきた。
本年度は、酸素バリア性フィルムを用いた手法に関して、新たな取り組みとして、海外研究協力者であるDiamond Light Sourceのグループが開発したX線ポンプ・プローブ法の導入を検討した。本手法では、SACLAからのX線をアッテネータにより弱くしたものを励起光源として利用し、はじめに金属活性中心の還元を行う。その後、アッテネータを利用していないXFEL光を利用することで、還元後の酵素の回折データを得るというものでる。本研究期間内には、NORを用いて、本手法を用いた時間分解構造解析を行うまでには、至らなかったが、別の試料での予備結果を得た。今後は、このX線ポンプ・プローブ法とケージドNOを用いた時間分解構造解析を組み合わせることで、NORの反応中間体の構造解析に取り組む。

現在までの達成度 (段落)

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] Diamond Light Source/エッセクス大学/インペリアルカレッジロンドン(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Diamond Light Source/エッセクス大学/インペリアルカレッジロンドン
• [国際共同研究] ゴッセンベルグ大学(スウェーデン)
  • 国名: スウェーデン
  • 外国機関名: ゴッセンベルグ大学
• [雑誌論文] A redox switch allows binding of Fe(II) and Fe(III) ions in the cyanobacterial iron-binding protein FutA from <i>Prochlorococcus</i> (2024)
  • 著者名/発表者名: Bolton,Machelett.Stubbs,Axford,Caramello,Catapano,Mal,Rodrigues,Cordery,Tizzard,MacMillan,Engilberge,von Stetten,Tosha,Sugimoto,Worrall,Webb,Zubkov,Coles,Mathieu,Steiner,Murshudov,Schrader,Orville,Royant,Evans,Hough,Owen,Tews
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 121 ページ: 1~6
  • DOI: 10.1073/pnas.2308478121
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Catalytic Oxidation of Methane by Wild-Type Cytochrome P450BM3 with Chemically Evolved Decoy Molecules (2023)
  • 著者名/発表者名: Ariyasu Shinya、Yonemura Kai、Kasai Chie、Aiba Yuichiro、Onoda Hiroki、Shisaka Yuma、Sugimoto Hiroshi、Tosha Takehiko、Kubo Minoru、Kamachi Takashi、Yoshizawa Kazunari、Shoji Osami
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 13 ページ: 8613～8623
  • DOI: 10.1021/acscatal.3c01158
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serial Femtosecond Crystallography Reveals that Photoactivation in a Fluorescent Protein Proceeds via the Hula Twist Mechanism (2023)
  • 著者名/発表者名: Fadini A、Hutchison C、Morozov D、Chang J、Maghlaoui K、Perrett S、Luo F、Kho J、Romei M、Morgan M、Orr C、Cordon-Preciado V、Fujiwara T、Nuemket N、Tosha T、Tanaka R、Owada S、Tono K、Iwata S、Boxer S、Groenhof G、Nango E、van Thor J.
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 145 ページ: 15796～15808
  • DOI: 10.1021/jacs.3c02313
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Time-resolved serial crystallography to track the dynamics of carbon monoxide in the active site of cytochrome <i>c</i> oxidase (2023)
  • 著者名/発表者名: Safari,Ghosh,Andersson,Johannesson,Bath,Uwangue,Dahl,Zoric,Sandelin,Vallejos,Nango,Tanaka,Bosman,Borjesson,Dunevall,Hammarin,Ortolani,Panman,Tanaka,Yamashita,Arima,Sugahara,Suzuki,Masuda,Takeda,Yamagiwa,Oda,Fukuda,Tosha,Naitow,Owada,Tono,Nureki,Iwata,Neutze,Brandon
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 9 ページ: 1~12
  • DOI: 10.1126/sciadv.adh4179
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 嫌気呼吸酵素を標的とした緑膿菌の抗菌薬開発に向けて (2023)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、川上凌平、Chai Gopalasingam、重松秀樹、西田優也、新谷泰範
  • 学会等名: 第2回生命金属科学シンポジウム
• [学会発表] ケージド基質の低温光解離を利用した金属酵素反応中間体の捕捉 (2023)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、武田英恵、榛葉幹治、堀谷正樹、城宜嗣
  • 学会等名: 第49回生体分子科学討論会
• [学会発表] Characterization of reaction intermediates of nitric oxide reductases involved in denitrification (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: ThermusQ高度好熱菌研究を切り拓くネオテクノロジー
• [学会発表] Characterization of the short-lived reaction intermediate of NO reductase with caged substrate (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: Dynamic Crystallography-XFELs and Synchrotrons to study enzyme reactions
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Mechanism of nitric oxide reduction by P450 in fungal denitrification (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: 日本薬物動態学会第38回年会/第23回シトクロムP450国際会議国際合同大会
  • 国際学会 / 招待講演