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2012 年度 実績報告書

基質消費スクリーニングを用いたテルペン酵素の機能進化

公募研究

研究領域生合成マシナリー:生物活性物質構造多様性創出システムの解明と制御
研究課題/領域番号 23108507
研究機関千葉大学

研究代表者

梅野 太輔  千葉大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00400812)

研究期間 (年度) 2011-04-01 – 2013-03-31
キーワードテルペン / 進化分子工学 / 代謝工学 / スクリーニング / 反応特異性 / カロテノイド / ランダム変異
研究実績の概要

我々が開発したテルペン活性のスクリーニング法では、基質消費活性が高いほど、つまり細胞活性が高いほど「より白い」コロニを形成する。「白さ」を指標として、テルペン酵素の細胞活性をハイスループットに見積もることができる。これを用いて,以下2つの方向で実験を行った。
(1) タバコ由来5-epi-aristolochene(防カビ剤の前駆体)合成酵素(TEAS),イチイ由来のタキサジエン(抗がん剤タキソールの前駆体)合成酵素(TaxS)を変異PCR法によってランダム変異 (~2変異/gene/世代)を導入し,ライブラリ化(多様化)した。つぎに,それぞれを黄色ブドウ球菌由来のC30カロテノイド合成経路とともにひとつの大腸菌内に発現させた。活性の無い酵素変異体の導入された大腸菌は,色素由来の黄色いコロニを与えたが,活性をもつ変異体を導入した細胞は,白っぽいコロニを与える。白いコロニから得た配列をサンプリングして解読したところ,ストップコドンやフレームシフト,そして重篤な構造破壊/機能低下をもたらす変異は完全に除去されていた。こうして,世界で初めて,テルペン酵素としての機能におけるMutability mapが描けることができるようになった。
(2) ゲラニオール酵素とTEASの2つの酵素について,ランダム変異→活性スクリーニング活性変異体を調べたところ,親よりも白いコロニーを幾つも得た。これらを解析したところ,細胞活性は有意に向上していたが,おもに異種発現性の向上によって説明できるものが殆どであった。

現在までの達成度 (段落)

24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

24年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (1件) 学会発表 (12件) (うち招待講演 4件)

  • [雑誌論文] Directed Evolution of Carotenoid Synthases for the Production of Unnatural Carotenoids2012

    • 著者名/発表者名
      Maiko Furubayashi and Daisuke Umeno
    • 雑誌名

      Methods in Molecular Biology

      巻: 892 ページ: 879-5

    • DOI

      10.1007/978-1-61779-879-5_14

  • [学会発表] 改良型ケラニオール合成酵素を用いた関連物質の微生物生産2013

    • 著者名/発表者名
      岩嵜 美希,藤井 爽,梶原 順,古林 真衣子,斎藤 恭一,梅野 太輔
    • 学会等名
      日本農芸化学会大会2013 大会
    • 発表場所
      東北大学
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-28
  • [学会発表] ヒト由来スクアレン合成酵素の生産物特異性部位の探索2013

    • 著者名/発表者名
      方波見 彰仁 斎藤 恭一 梅野 太輔
    • 学会等名
      日本農芸化学会大会2013 大会
    • 発表場所
      東北大学
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-28
  • [学会発表] タイミング回路の進化工学と変異体解析2013

    • 著者名/発表者名
      池 紘平,福冨 浩樹,河合 繁子,斎藤 恭一,梅野 太輔
    • 学会等名
      日本農芸化学会大会2013 大会
    • 発表場所
      東北大学
    • 年月日
      2013-03-26 – 2013-03-27
  • [学会発表] 液体ハンドリングのみによって行う微生物ケノムの連続編集2013

    • 著者名/発表者名
      冨永 将大、嶋村 陽、曽和 義幸、川岸 郁朗、斎藤 恭一、梅野 太輔
    • 学会等名
      ゲノム微生物学会
    • 発表場所
      長浜バイオ大学
    • 年月日
      2013-03-08
  • [学会発表] Development of the evolutionary design platform for genetic switches and circuits2012

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Umeno
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Symposium
    • 発表場所
      広州(中国)
    • 年月日
      2012-11-29
    • 招待講演
  • [学会発表] Evolutionary pathway engineering: toward the fast-track construction of long-step, but high-fidelity pathway for non-natural compounds2012

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Umeno, Maiko Furubayashi, and Kyoichi Saito
    • 学会等名
      SBJ/JST Joint Symposium IV -System Synthetic Biotechnology
    • 発表場所
      神戸国際会議場
    • 年月日
      2012-10-26
    • 招待講演
  • [学会発表] 基質消費スクリーニングを用いたゲラニオール合成酵素の活性進化2012

    • 著者名/発表者名
      梶原 順,岩嵜 美希,古林 真衣子,斎藤 恭一,梅野 太輔
    • 学会等名
      第22回ドリコールおよひイソプレノイト研究会
    • 発表場所
      新潟大学
    • 年月日
      2012-09-29
  • [学会発表] 非天然骨格スクアレンおよびそれらを基にした非天然化合物の生合成2012

    • 著者名/発表者名
      方波見彰仁, 斎藤恭一, 高市真一, 梅野太輔
    • 学会等名
      第22回ドリコールおよひイソプレノイト研究会
    • 発表場所
      新潟大学
    • 年月日
      2012-09-29
  • [学会発表] 進化分子工学を援用した代謝経路と制御ネットワークの高速開発2012

    • 著者名/発表者名
      梅野太輔
    • 学会等名
      化学工学会第44回秋季大会
    • 発表場所
      東北大学
    • 年月日
      2012-09-20
    • 招待講演
  • [学会発表] Evolving Escherichia coli Activity of Terpene Synthases Using Color Screening for Substrate Consumption2012

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Umeno, Mayu Ikezumi, Maiko Furubayashi, Jun Kajiwara, Miki Iwasaki, and Kyoichi Saito
    • 学会等名
      International Conference of Natural Products Biosynthesis (ICNPB)
    • 発表場所
      淡路(夢舞台)
    • 年月日
      2012-06-17
  • [学会発表] Evolutionary engineering of biosynthetic pathways for non-natural C50 carotenoids2012

    • 著者名/発表者名
      Maiko Furubayashi, Li Ling, Shinichi Takaichi, Kyoichi Saito Daisuke Umeno
    • 学会等名
      International Conference of Natural Products Biosynthesis (ICNPB)
    • 発表場所
      淡路(夢舞台)
    • 年月日
      2012-06-17
  • [学会発表] 代謝経路路のコンテキストにおける酵素の進化#12079;学2012

    • 著者名/発表者名
      梅野太輔
    • 学会等名
      新資源生物変換研究会シンホシウム
    • 発表場所
      神戸大学
    • 年月日
      2012-06-15
    • 招待講演

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公開日: 2018-02-02  

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