2017 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chromosome Orchestration System |
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15H05974
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩崎 博史 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232659)
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| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
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| Keywords | DNA 二重鎖切断 / DNA修復 / 相同組換え / Rad51 リコンビナーゼ / 接合型変換 / DNA鎖交換反応 / Swi5-Sfr1 複合体 / リアルタイムアッセイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAの二重鎖切断（DNA double strand break; DSB）は、細胞にとって最も危機的なDNA損傷の一つである。DSBの修復には相同組換えが主要なDNA修復機構の一つとして機能する。本計画では、DSBが導入された染色体はいかなるメカニズムによってDSB修復を実現しているのか、染色体の時空間制御機構解析、組換え反応の試験管内再構成系、さらに、リアルタイム解析・１分子解析などによって多面的に切り込み、且つ、接合型変換をモデル系として4D情報を解析することで、DSB修復装置が核内でどのように時空間を制御して作動するのか、分子基盤や基本原理を明らかにしようとしている。特に、申請者が発見した相同組換え因子を主軸に、分裂酵母をモデル系としてDSB の修復過程における染色体の３Ｄ・４Ｄダイナミズムを明らかにしようとするもので、当該年度は次の実績をあげた。
（１）相同組換えによるDNA二重鎖切断修復の3D 構築解析として、蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を用いて、Rad51 presynaptic フィラメント形成とDNA鎖交換反応のリアルタイム解析を行った。その結果、FRETを用いたリアルタイムアッセイ系から、DNA鎖交換反応が3ステップで進行することを見出した。さらに、Swi5-Sfr1やCa2+が、どのステップを活性化するのかを解明した。これらを纏めて論文として発表した。
（２）分裂酵母の接合型変換に関与する遺伝子を網羅的に明らかにする目的で、欠失ライブラリーを作成して、すべての非必須遺伝子について、接合型変換能を解析した。その結果、新たにSet1/C複合体が接合型変換に関与することを発見した。
（３）RI施設が使えなくなったので、ATPase活性の測定ができなくなったが、繰越期間にこれに代替する測定法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度までに、蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)を用いたRad51によるDNA鎖交換反応の2つのアッセイ系、DNA strand displacement (DSD) アッセイとDNA strand pairing (DSP) アッセイを確立して、リアルタイムでDNA鎖交換をモニターすることに成功した。これを用いて、反応速度論についてシミュレーションを行い、この反応が、２つの反応中間体（C1とC2）を通る3ステップで進行することを明らかにした。その上で、Swi5-Sfr1複合体は、C1-C2トランジッションとC2から短鎖DNAの放出の2つのステップを促進することを明らかにした。これには、ATPの加水分解を必要とした。一方、Ca2+は、ATP加水分解非依存的、且つATP結合依存的に、C1-C2トランジッションを促進した。しかし、Ca2+は、C2から短鎖DNAの放出を促進することはなかった。これらを纏めて論文として発表した。
更に詳細にメカニズムを解析する目的で、いくつかのRad51変異体を作成した。これらのDNA依存的ATPase活性を解析しようとしたが、所属機関での放射線総合センターが閉鎖となり、RI実験ができなくなったので、RIを使用するATPase活性ができなくなったので、繰越期間に、これに替わる方法論の開発を行った。
一方、接合型変換に関しては、当初計画を変更して、接合型特異的に蛍光タンパク質を産生する株を作成し、接合型変換能をより容易にかつ正確にアッセイするシステムを構築した。このシステムを用いて、接合型変換に関与する遺伝子の網羅的解析を完成した。さらに、得られた候補遺伝子を幾つかをin-depth 解析し、Set1/C複合体がこれに関与することをわかったので、これらに関して論文投稿の準備をした。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）放射線総合センターが使用できないことにより、ATPase測定関係の実験が遅れたが、現在、代替法を確立したので、これを用いて、遅れている計画を解消すべく重点的に研究を行う。とくに、Rad51 によるDNA鎖交換反応の解析については、これまでに、多数のRad51変異株を分離して、それぞれの変異タンパク質を精製し、遺伝学的解析や生化学的解析を行ってきた。これらミュータントのATPase活性を測定する。また、それぞれ、本申請研究においてこれまで明らかにした各々のステップに欠損があると予想されるものがいくつか候補として上がってきた。そこで、今回確立したFRETを用いたリアルタイムアッセイを行い、これらミュータントにおいて反応のどのステップに欠損があるのかを解析する。
２）接合型変換の分子機構：Set1/Cがどのように接合型変換に関与するのか、ChIP-Seqなどをつかって、mat領域のクロマチン構造を解析することで、本質的問題解決に迫る。
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Research Products
(19 results)
