Coordination of chromosome behavior based on the replication of chromosomal 3D structure

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Chromosome Orchestration System
• Project/Area Number: 15H05975
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 荒木 弘之 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 特任教授 (20151160)
• Project Period (FY): 2015-06-29 – 2020-03-31
• Keywords: DNA 複製 / 染色体 / 細胞周期

Outline of Annual Research Achievements

真核生物染色体DNAの複製開始は、細胞周期の鍵であるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)により促進される。出芽酵母では、複製タンパク質Sld2とSld3がCDKによりリン酸化され、Dpb11タンパク質と結合することにより、複製が開始する。精製タンパク質からなるin vitro複製系でも、Sld2及びSld3のリン酸化は複製開始に必須であるが、Sld3のリン酸化要求性はin vivoと異なることを前年度に示した。さらに今年度は、Sld3と結合するCdc45の変異で、CDKがSld3をリン酸化しなくても複製を開始するCdc45JET1は、in vitro複製を野生型Cdc45以上に促進し、リン酸化部位を多く含むSld3のC末部位を欠いたものでも、複製開始が起こすことができることが分かった。
Sld3タンパク質のN末はSld7タンパク質のN末と結合する。Sld7タンパク質はC末で２量体化するため、２分子のSld3と２分子のSld7からなるヘテロ４量体ができる。この複合体の機能を知るため、Sld7のC末をリガンドにより２量体化するDmrBドメインに置換し、in vitroでの複製反応を調べた。その結果、C末を欠くSld3を用いると顕著に２量体化した方が、複製反応をより促進することが分かった。一方、細胞内では２量体化しない場合には、DNA鎖を切断するZeocinに弱く感受性を示した。これらのことは、Sld7タンパク質の２量体化の複製開始への寄与を示唆する。
複製フォークは、DNAダメージに遭遇したり、DNA合成の基質であるヌクレオチドが欠乏したりすると停止する。出芽酵母rDNAでは、この領域に結合するFOB1タンパク質により、複製フォークが方向特異的に停止するが、この系にはDbf4依存性キナーゼ(DDK)が必要であることを前年度までに明らかにした。この反応に必要なタンパク質のDDKによるリン酸化の有無と、フォークの停止を調べたが、特定のタンパク質のリン酸化が複製フォーク停止の決め手とはなっておらず、DDKそのものが構造体として効いている等の可能性が示唆された。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Recombination and Pol ζ rescue defective DNA replication upon impaired CMG helicase-Pol ε interaction. (2020)
  • Author(s): Denkiewicz-Kruk, M., Jedrychowska, M., Endo, S., Araki, H., Jonczyk, P., Dmowski, M., Fijalkowska, I.J.
  • Journal Title: Int. J. Mol. Sci. Volume: 21 Pages: 9484
  • DOI: 10.3390/ijms21249484
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research