2016 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | New Photosynthesis : Reoptimization of the solar energy conversion system |
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| Project/Area Number |
16H06556
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
久堀 徹 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (40181094)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 啓亮 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (40632310)
矢守 航 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (90638363)
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| Project Period (FY) |
2016-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | ATP合成酵素 / γサブユニット / εサブユニット / 酸化還元制御 / サイクリック電子伝達 / チオレドキシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画班では、①プロトン駆動力形成の理解に基づく機能強化、②プロトン駆動力消費過程の理解に基づくATP合成能力の向上、③還元力の再分配を主眼として、プロトン駆動力制御による光合成の再最適化を最終目標として研究を行っている。本年度は、これについて、下記の通り、研究を進めた。
①プロトン駆動力形成機構を解明するために、リニア経路の律速要因であるシトクロムb6f複合体とATP合成酵素、また、サイクリック経路を構成するPGR5タンパク質とNDH複合体の過剰発現株、発現抑制株、変異株の選抜を行った。また、変動光に対する光合成応答機構を包括的に解明するために、変異体のスクリーニング方法を構築した。
②ATP合成酵素によるプロトン駆動力の消費を研究する足がかりとするため、シアノバクテリアを材料として簡便に複合体を調製する準備を進めた。βサブユニットのN末端側にHisタグを導入することで、チラコイド膜を界面活性剤で可溶化後に、ワンステップで高純度の複合体標品を得る手法を確立した。また、光合成生物のATP合成酵素特有の制御機構を理解するため、γサブユニットとεサブユニットについて、それぞれ生化学・構造生物学的な研究を進めた。
③還元力の再分配を理解するため、酸化還元制御の鍵タンパク質であるチオレドキシンに注目し、複数のチオレドキシンアイソフォームへのフェレドキシン－チオレドキシン還元酵素からの還元力の供給経路、個々のチオレドキシンアイソフォームから標的タンパク質への還元力供給経路のそれぞれについて、速度論的解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①イネにおいて、シトクロムb6f複合体とATP合成酵素、PGR5タンパク質の発現抑制株とNH複合体の欠損体を選抜し、シロイヌナズナにおいては、PGR5タンパク質の過剰発現株を複数選抜することができた。また、変動光環境下における変異体スクリーニングによって、複数の候補株を得ることができた。
②研究計画で記述したATP合成酵素のプロトン輸送経路の変異導入を実施するため、膜タンパク質複合体であるATP合成酵素の活性測定系の確立を進めた。その結果、シアノバクテリアを材料として、簡便に高純度のATP合成酵素複合体標品を得る手法を確立し、脂質再構成小胞に埋め込むことで活性測定も実現した。光合成生物のATP合成酵素γサブユニット特有の制御領域については結晶構造解析を進め、阻害サブユニットであるεサブユニットについては阻害の分子機構に関する生化学および1分子解析実験を行った。
③還元力の再分配を理解するため、酸化還元制御の鍵タンパク質であるチオレドキシンに注目し、チオレドキシンへの還元力供給経路、チオレドキシンからの還元力供給経路のそれぞれについて、速度論的解析を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
①今後、得られた各種形質転換体を用いて、CO2固定速度、気孔開度、光化学系Iや光化学系IIの電子伝達速度を解析する。さらに、膜電位（ΔΨ）やH+勾配（ΔpH）、そして、ATP合成酵素の活性等も測定し、プロトン駆動力形成機構の解明に臨む。また、変動光環境下におけるスクリーニングを継続して行う。スクリーニングによって得られた変異体については、TAIL-PCRによって候補遺伝子を同定する。
②シアノバクテリアより調製したATP合成酵素複合体を用いたリポソーム再構成系を確立し、人為的に形成したプロトン勾配によるATP合成活性を測定する。阻害サブユニットであるεサブユニットの機能ドメイン毎の機能の解析を、生化学および1分子観察の両面で進める。γサブユニットとεサブユニットの共結晶の構造解析を進め、機能に重要と予想される部位を特定して、生化学実験による確認を行う。
③還元力の再分配の鍵となるチオレドキシンについては、複数のアイソフォーム毎の還元力フローを測定し、どのような経路を介して還元力伝達が行われるのか、マップの構築を目指す。また、シアノバクテリアについても、同様の研究、およびチオレドキシン経路の欠損株のフェノタイプの解析によって、この制御機構の生理的な重要性を明らかにする。
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