2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of optical probes and actuators to investigate singularity cells
| Project Area | Singularity biology |
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| Project/Area Number |
18H05410
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | イメージング / 蛍光 / 発光 / 生理機能操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、将来のAMATERASでの観察に用いる各種標識プローブおよび生体操作ツールの展開に向けて、基盤技術の開発に重点を置いた。以下の1, 2, 3の目標に対してそれぞれ開発を行った。
1.化学発光を利用した機能イメージング法の開発: 化学発光を基本原理とした各種生体プローブの開発および、化学発光と光照射による操作を組み合わせた制御ツールの開発に着手した。さらに、生体プローブに用いる上で有利な、赤色あるいは近赤外色の高光度化学発光タンパク質の開発に向けて、ルシフェラーゼ種及びFRETにより長波長へシフトさせるための蛍光タンパク質の選抜を行った。
2. 時空間トランススケール生体操作ツール群の創出とシンギュラリティ現象の操作法開発: 各種生理現象の制御・操作を実現する分子ユニットの開発に着手した。 まず光による生体分子の制御 (オプトジェネティクス) の実現に向け、青色光受容体タンパク質CRY2やLOV2が光に応答して生じる集合/解離や開閉、さらに分割タンパク質再構成法などを利用した生理機能操作分子ユニットの開発を目標とし、その開発基盤となるスクリーニング、顕微鏡観察などのシステム構築を行った。
3. 計画班の各研究開発に連動した生体分析プローブの開発: 各計画班で標的にするシンギュラリティ現象を検出するための生体分析プローブを共同で開発した。既に単離に成功している色素タンパク質を利用した新規イメージング手法の提案に向けて、各種基礎データの取得を行った。またA03計画班で標的としている生命現象に対してイメージングをする上で可能な検出原理を提案し、実際にプローブの開発に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 化学発光による生体プローブ開発に複数取り組む課程で、一つのプローブにて化学発光と蛍光タンパク質の両方による標識をそれぞれ使用可能な、バイモーダルトランススケールプローブの原理を確立した。同原理による生理機能プローブおよびそのプローブを使用した観察システムの開発を行い、細胞中Ca2+などの因子の増減を、化学発光と蛍光の両方を用いてリアルタイムに検出することに成功した。
2. 次年度以降に行うオプトジェネティクスツール開発の効率化を図るためのシステム構築を中心に行った。具体的には、マルチウェルプレート対応顕微鏡電動ステージを導入し、生細胞内で行うオプトジェネティクスツール評価をハイスループットに行う仕様を整備した。また、顕微鏡上で細胞の培養を継続しながら薬液添加を実現する装置の設計・開発を行い、顕微鏡ステージインキュベーター内に搭載した。これらを既存の1分子蛍光顕微鏡に搭載することで、オプトジェネティクスツールの生細胞内ハイスループット機能評価を行うシステムを構築した。本システムは青色光および深赤色光の照射装置を備えているため、各種オプトジェネティクスツールの高効率スクリーニングを推進する準備が整った。
3-1. 光音響イメージングに適した遺伝子にコードされた光音響プローブの開発 (A01-1班との連携): 色素タンパク質の光音響効果を精査したのち、その結晶構造解析を試みた。また変異導入などによって異なる特徴を有する改変体の作出にも着手した。
3-2.タウ凝集を検出する化学発光プローブの開発 (A03-1班との連携): 細胞中でタウタンパク質が凝集してポリマーを形成する課程を特異的に検出する化学発光プローブの開発に着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 長波長化学発光プローブの開発: 赤色あるいは近赤外色の発光プローブ開発を引き続き行う。高光度化学発光タンパク質 (NanoLuc) にモノマータイプの長波長蛍光タンパク質を繋げることで、FRETにより発光波長を変換し且つ発光強度を増加させる。高効率にFRETが生じる小分子サイズの新規化学発光タンパク質を開発しその性能を評価する。各種蛍光タンパク質、色素タンパク質の改良: 緑色蛍光タンパク質Gamillusが有する抗酸性を保持したまま、短波長もしくは長波長へシフトした変異体を開発する。また光音響プローブ使用を検討している色素タンパク質においても、蛍光性を有する変異体の作製などその改良を進める。
2. 既に技術的優位性が確立されている青色光受容体を用いたオプトジェネティクスツールの開発を中心に行う。具体的には植物光受容体LOV2-Jαを用いてRNA結合タンパク質ドメインPUM-HDの機能を制御する、光応答性RNA捕捉ツールを開発する。前年度に構築した顕微鏡ベースのオプトジェネティクスツールハイスループット機能評価システムを用いて光応答性RNA捕捉ツールの設計最適化を行い、より高性能なオプトジェネティクスツールを選抜する。また長期計画として近赤外や硬X線、磁場などの照射による生物個体深部におけるオプトジェネティクスツール開発を行う。
3-1. Ca2+など特定のイオンに対して、あるいは化学物質の結合により光吸収係数(熱産生)が変化する光音響プローブを、独自単離した色素タンパク質を用いて開発する。
3-2. タウの凝集に応じた発光が検出されるか実際の細胞モデルを用いて検証する。凝集の各ステップをそれぞれ区別して検出できるように、タウタンパク質のドメインを複数準備してプローブに利用する。
4. 公募班の研究内容について、関連し共同で進めるのが相応しいものについては連携して開発を進める。
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