2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of optical probes and actuators to investigate singularity cells
| Project Area | Singularity biology |
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18H05410
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | イメージング / 蛍光 / 発光 / 生理機能操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は領域発足時より進めている、各種可視化プローブおよび細胞操作ツールの開発を引き続き行い、実際に生きた細胞に導入してその性能を評価した。また領域内での連携を通して研究・開発の促進に努めた。以下の1、２，３の課題を設定してそれぞれ行った。
1. 蛍光・化学発光を利用したリアルタイム機能イメージング法の開発: 組織や個体内の１細胞機能を捉えるための、蛍光および化学発光を利用した細胞機能プローブの開発を行った。異なる波長の蛍光タンパク質を用いた複数標的の同時観察を目的として、蛍光タンパク質Gamillus短波長変異体の改良およびGFP変異体Sumireを用いた蛍光プローブの開発を進め、その性質を評価した。
2. 時空間トランススケール生体操作ツール群の創出とシンギュラリティ現象の操作法開発: 技術的優位性が確立されている青色光受容体を用いたオプトジェネティクスツールの開発を中心に行った。具体的にはアルツハイマー病の原因となるタウの凝集を光照射により誘導する分子ツールの開発やホスファチジルイノシトール（3,4,5）三リン酸（PIP3）の光産生ツールを用いたPIP3の定量的操作系の開発を行った。
3. 領域内での連携による各開発: A03生物班や公募班の要望に応じて可視化・操作用プローブの開発およびイメージングなどの技術支援を行い、段階的に成果を得た。
開発した各ツールの性能評価については、次年度以降行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 耐酸性緑色蛍光タンパク質Gamillusの短波長蛍光を示す変異体に対し、アミノ酸へのランダム変異の導入によりその蛍光特性の向上を目指した。複数の変異体を得ることができ一部で蛍光強度の増加などが確認された。
2. ホスファチジルイノシトール（3,4,5）三リン酸（PIP3）の光産生ツールを用いたPIP3の定量的操作系の開発を行った。PIP3産生酵素であるPI3Kの機能ドメインを光照射により細胞膜へリクルートする分子ツールを用い、生細胞におけるPIP3産生を光操作した。この細胞において、PIP3結合タンパク質ドメインに赤色蛍光タンパク質mCherryを融合したものをPIP3センサーとして発現し、全反射蛍光顕微鏡を用いてPIP3の定量を行う系を開発した。
3. A03-1班との連携として、アルツハイマー病に見られるタウタンパク質凝集を検出する化学発光プローブおよび光操作ツールの開発を行った。化学発光プローブでは、蛍光タンパク質との融合により、タウタンパク質凝集に伴い発光が増加する仕組みを構築し、実際に培養細胞内でのタウ凝集が検出できることを確認した。光操作ツールでは、青色光受容体とタウタンパク質を組み合わせて、培養細胞中のタウタンパク質を光照射により凝集できるツールopto-tauを構築した。さらに青色光の届かない生体深部でもタウ凝集の誘導ができるよう、青色発光タンパク質と融合したopto-tauを作成した。
蛭田公募班と共同で長時間の生細胞発光イメージングを実現する発光基質を開発した。蛭田班が開発したピバロイル修飾フリマジンを用いて生細胞発光観察を行った。その結果、通常のフリマジンでは２時間程度で発光強度が減衰するのに対し、ピバロイル修飾フリマジンでは6時間を超えて一定の発光強度を維持した。この成果は国際英文誌であるOrg. Biomol. Chem.に原著論文として発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
耐酸性蛍光タンパク質の多色化: 獲得した複数の変異体に対して再度ランダム変異を導入して、オリジナルのGamillusと同程度の蛍光輝度を有する変異体を獲得する。オリジナルと変異体を組み合わせて細胞内の複数の事象を同時に観察する。
生体適応性を示す外部刺激応答ユニットの開発: ダウンコンバージョンやアップコンバージョンを示すナノ粒子やルシフェラーゼを用いた生体内部で発生する青色光を用いた操作系、ferritin変異体内で自発的に形成する磁性ナノ粒子を用いた操作系など、各種マテリアルを利用することで、生体深部での機能発現を指向した生体変換ユニット群の設計・開発を目指す。
開発したピバロイル修飾フリマジンにおける保護の原理を利用し、さらに長寿命かつ高い水溶性を示すNLuc発光基質の開発を目指す。
各種生理現象の光制御・操作を実現する分子ユニットの開発：細胞内PIP3産生光操作系について、光応答型PI3KとPIP3産生の同時画像定量化を試みる。その結果を元に、光照射量および継続時間に対する光応答型PI3Kの活性およびPIP3産生量の関数を得て数理モデル化を目指す。
タウタンパク質凝集を検出する化学発光プローブおよび光操作ツールによる凝集進行のイメージング: 開発した化学発光プローブについて、その性能をマウス神経芽細胞を用いて評価する。光操作ツールと組み合わせて、光刺激による人為的な凝集が当該細胞内および周囲の細胞に伝播するかどうか、マウス神経芽細胞を用いて検証する。さらに青色発光タンパク質と融合した系を用い、基質添加により青色光を発生させタウの凝集を誘導する系も検証する。
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[Journal Article] Long-term single cell bioluminescence imaging with C-3 position protected coelenterazine analogues2021
Author(s)
Mizui, Y., Eguchi, M., Tanaka, M., Ikeda, Y., Yoshimura, H., Ozawa, T., Citterio, D., Hiruta, Y.
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Journal Title
Organic & Biomolecular Chemistry
Volume: 19
Pages: 579, 586
DOI
Peer Reviewed
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