2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of single-molecule methods measuring energy conversion processes of biological and synthetic molecular engines
| Project Area | Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion |
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| Project/Area Number |
18H05424
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
飯野 亮太 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笠井 倫志 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | １分子計測 / 分子モーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) 金属ナノプローブ１分子計測法の開発（飯野）：金属材料の最適化や照明光学系の改善により、粒径40nmの金ナノ粒子で、1Åの位置決定精度と1msの時間分解能を達成した。また、より小さな粒径30nmの金ナノ粒子を1.9Åの位置決定精度と1ミリ秒の時間分解能でイメージングすることに成功した。さらにこの実験を利用し、リニア分子モータープロセッシブキチナーゼの作動機構を解明した。
(2) 金属ナノプローブと蛍光の１分子複合計測（飯野）：金属ナノプローブ表面のプラズモン共鳴による局所的電場増強を利用した、金属ナノプローブと蛍光プローブの１分子複合計測法を開発した。具体的には、いわゆる全反射型蛍光顕微鏡のダイクロイックミラーとバリアフィルターを穴あきミラーに交換し、金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置を開発した。金ナノ粒子表面の電場増強により2倍の蛍光強度が得られた。さらに開発した実験系を回転分子モーターV1-ATPaseに適用し、蛍光標識ATP（ADP）の結合（解離）と回転運動の同時観察に成功した。
(3) 蛍光複合計測による１分子動態観察（笠井、飯野）：細胞膜中で働く人工チャネル分子の機能を直接に蛍光計測するためのツールの検討を行った。具体的には、細胞膜の電位を測定するツールを用いて、生理的な条件で細胞を刺激した際に、測定可能なシグナル変化をとらえることができるかを調べた。その結果、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた膜電位プローブによって、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることができた。
(4) 高速AFMによる１分子観察・操作（飯野、内橋）：我々が以前開発した高速AFM／１分子蛍光顕微鏡複合機の１分子蛍光のS/Nを、金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用いてさらに改善することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 金属ナノプローブ１分子計測法の開発（飯野）：粒径40nmの金ナノ粒子で、1Åの位置決定精度と1msの時間分解能を達成できた。さらに、より小さな粒径30nmの金ナノ粒子を1.9Åの位置決定精度と1ミリ秒の時間分解能でイメージングすることに成功した。
(2) 金属ナノプローブと蛍光の１分子複合計測（飯野）：金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置の開発に成功した。また、金ナノ粒子表面の電場増強により、蛍光強度を2倍に改善することができた。
(3) 蛍光複合計測による１分子動態観察（笠井、飯野）：蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた細胞膜内層の膜電位状態を測定するプローブ（MCS+, Ma et al., Nat. Biotechnol., 2017）により、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることに成功した。すなわち、ドーパミン受容体の刺激によって、細胞膜内層側の膜電位状態が変化すること、さらにこの反応は数十秒以上持続することを明らかにできた。
(4) 高速AFMによる１分子観察・操作（飯野、内橋）：金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用い、高速AFM／１分子蛍光顕微鏡複合機の蛍光シグナルを改善することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
開発した１分子計測法の改良を継続しつつ、生体・人工・ハイブリッド発動分子の計測に取り組む。尚、来年度からは内橋は研究協力者から外れ、公募班代表者として本新学術領域に参画する。このため今後は、本課題の高速AFM部分は内橋が公募研究で担当する。
(1) 金属ナノプローブ１分子計測法の開発（飯野）：リニア型生体発動分子のダイニンは、キネシン-1やミオシンVと異なり構成部品間の協調性がなくても一方向に運動できると考えられている。これらの非協調性生体発動分子の運動とエネルギー変換の仕組みを明らかにする。さらに、DNAオリガミ上を動く非天然ダイニン（A01-2班が創成）の計測を行い、運動素過程やエネルギー変換の機構を解明する。
(2) 金属ナノプローブと蛍光の１分子複合計測（飯野）：異方的な環境場である生体膜でエネルギー変換を行う回転型生体発動分子V-ATPaseの１分子複合計測を行う。V-ATPaseは、回転運動を介してATPの化学エネルギーをイオンの電気化学ポテンシャルに変換する。回転運動とイオン輸送の素過程を可視化してその仕組みを明らかにする。さらに、A01-2班が創成する非天然型V-ATPaseの１分子複合計測を行う。
(3) 蛍光複合計測による１分子動態観察（笠井、飯野）：生体膜中に組み込んだ人工発動分子を蛍光１分子観察し、発動分子が機能発現する過程を明らかにする。A01-1班の人工イオンチャネルの会合形成やA01-3班の人工分子針の伸縮運動と物質輸送を同時に計測して、仕組みを理解する。発動分子と輸送プローブを二色同時蛍光１分子観察し、ダイナミックな会合体形成や構造変化が物質輸送に繋がる仕組みを解明する。
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