2019 Fiscal Year Annual Research Report
Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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| Project/Area Number |
19H05761
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
城 宜嗣 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (70183051)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体鉄 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造解析 / ヘム鉄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．へムを活性中心に含む根粒菌の酸素センサータンパク質FixL/FixJシステムを研究対象に、結晶ならびに溶液構造解析を行った。FixLの酸素センサードメイン（Tandem PAS domain）の結晶構造を明らかにした。酸素感知活性型と不活性型の構造比較から、二量体界面でのわずかな構造変化がATPリン酸化部位に伝達される機構を提案した。また、FixJ全長の溶液構造と細胞内での構造の差異を明らかにすることを目的に、13Cと15Nでラベルした試料を用いてin vitroとin cell NMRの測定を行っている。今年度は約70％のNMRシグナルの帰属が完了した。
２．病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのX線結晶構造解析に成功した。ヘム結合型、ヘム非結合/DNA結合型、ヘム結合/一酸化炭素（CO）結合型の構造を得て、それらの構造変化から、PefRが病原菌内でのヘム濃度を感知して転写因子として機能する分子機構を提案した。さらに、PefRは宿主のヘム分解によって産生される細胞毒COをスキャベンジするシステムとして機能していることを新たに見いだした。
３．病原菌の鉄取込みポンプ（インポーター）の溶液構造解析（低温電子顕微鏡（クライオEM））、鉄排出ポンプ（エクスポーター）のX線結晶構造解析を行った。
４．ヒトの小腸での鉄吸収で重要な機能を果たしている鉄還元酵素（Dcytb）の結晶構造を基盤に、その機能を細胞内で評価するシステムを構築している。ヒト腸管のモデル細胞であるCaco-2細胞の細胞膜にDcytbを発現させる事に成功した。また、Dcytbで還元された鉄を腸管細胞に取込む際に機能するトランスポーター（DMT1）の発現精製を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．FixL Tandem PAS domainの構造を基盤に提案した酸素感知機構を検証する必要がある。全長FixJのNMR構造解析は順調に進んでいる。
２．病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのヘム感知機構を提案したが、個々のアミノ酸残基やドメインの機能までは踏み込んでいないので、そこは検証の必要がある。
３．病原菌のヘムエクスポーターのX線結晶構造解析は順調に進んでいる。ヘムインポータのクライオEM解析は、今は測定に適した試料を作成する目的で、ナノデスク作成の条件を検討中である。
４．ヒト小腸での鉄吸収を可視化するモデル細胞の構築は順調に進んでいる。鉄トランスポーター（DMT1）の発現は確認しているが、単離精製までには至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．FixL Tandem PAS domainの構造において重要と目されるアミノ酸の変異体を作成し、その酸素感知機能を測定する。常磁性金属を活用して全長FixJのin vitro NMR構造解析を進める。同時に、in cell NMR測定の準備も進める。
２．病原菌のヘムセンサータンパク質PefRのヘム感知における個々のアミノ酸残基やドメインの役割を明らかにする目的で変異体の解析を進め、感知機構を検証する。
３．病原菌のヘムエクスポーターのX線結晶構造解析を完成させ、ヘムインポーターのクライオEM用の試料を作成（ナノデスク）条件を確定させる。
４．ヒト小腸での鉄吸収のモデル細胞を用いて、Dcytbの各種変異体の機能解析や鉄錯体のキレーターの評価を行う。Dcytbに加えてDMT1の発現も試み、ヒト小腸での鉄取込むの全体像の可視化をめざす。DMT1の単離精製方を確立し、構造解析をめざす。
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