2013 Fiscal Year Annual Research Report
in vitro において卵を産生する新規技術の開発
| Project Area | Mechanisms regulating gamete formation in animals |
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| Project/Area Number |
25114008
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
尾畑 やよい 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (70312907)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平尾 雄二 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, その他部局等, 研究員 (10355349)
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| Project Period (FY) |
2013-06-28 – 2018-03-31
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| Keywords | 卵母細胞 / インプリント / 卵母細胞形成 / 体外培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
in vitroにおいて卵を産生する新規技術開発を目的として平成25年度は、1）卵母細胞成熟マーカーの探索、2）in vitro培養系の開発、および3）卵のインプリント機構解明の研究を進めた。
1）卵母細胞成熟マーカーの探索 フルサイズの卵のRNA-seq解析の結果は、既にデータベース上に存在するが、卵母細胞形成過程における遺伝子発現プロファイルは未だに報告がない。そこで、卵母細胞形成過程における遺伝子発現プロファイルを構築することを目的として、マウスより各成長ステージの卵母細胞（20 um未満；非成長期、40ー50 um；初期成長期、50－60 um；中期成長期、60ー65 um；後期成長期、75 um以上；フルサイズ）を200～5000個採取した。これらより5 ngのRNAを採取し、RNA-seq解析の準備を行った。
2）in vitro培養系の開発 成長期卵母細胞から産仔まで発生可能な卵をin vitroで産生する技術は既報があるが、国内外を通じて例数が乏しくin vitro由来卵の発生能は2%程度と極めて低い。そこで我々は、成長期卵母細胞のin vitro growth系を開発した。培地に高分子化合物を添加し、その発生能を比較した結果、従前の報告を大幅に上回り10%以上が産仔へと発生することを見いだした。
3）卵のインプリント機構解明 卵のインプリントにはDNAメチル基転移酵素DNMT3Aとその補酵素DNMT3Lが不可欠であり、インプリントが成立する前の非成長期卵母細胞ではこれらも発現が認められない。そこで、これが非成長期卵で発現するTgマウスを作製し、DNAメチル化インプリントが成立するか否か解析した。その結果、DNMTsは十分発現しているにもかかわらず、非成長期卵母細胞ではDNMTsがインプリント領域に機能できず、インプリントが成立しないことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究分担者との連携が良好で、2）「in vitro培養系の開発」および3）「卵のインプリント機構解明」については当初の計画以上に研究が進んだ。申請者のこれまでの研究報告では、成長期卵母細胞から産仔へ発生可能な成熟卵をin vitroで産生した成功例はなかったが、平成25年度は、成熟卵の産生に成功したのみならず、既報を大きく上回る成功率となった。また、インプリント機構を解析する過程で、卵のインプリント成立にはDNAメチル基転移酵素がインプリント領域にアクセスするための分子が必要であるという新たな知見が得られた、その成果を1報の論文に発表することができた。
1）「卵母細胞成熟マーカーの探索」のためのRNA-seq解析については、今年度、in vitro由来卵母細胞のRNA-seq解析まで行う予定であったが、専門知識や共通の研究背景を有する研究員の確保が困難であったため、平成26年度に雇用費および解析のための経費を繰越、研究の実施を先送りせざるを得なかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vitroにおいて卵を産生する新規技術開発を目的として平成26年度は、引き続き、1）卵母細胞成熟マーカーの探索、2）in vitro培養系の開発、および3）卵のインプリント機構解明の研究を進める。
1）卵母細胞成熟マーカーの探査 各成長ステージのin vivo由来卵母細胞より採取したRNAよりライブラリーを構築しRNA-seq解析を実施する。RNA-seqのデータを各成長ステージで比較し、成長や成熟に伴い発現変化の見られる遺伝子やインプリントに寄与する可能性のあるエピジェネティック関連因子の抽出を試みる。in vitro由来卵母細胞についても同様のRNA-seq解析を実施する予定である。一方、「同じ種類の細胞であるにもかかわらず分化前と分化後でtotal RNA量自体に数千倍の差が生じる」という点で卵母細胞成長過程のRNA-seqは前例がない解析であることから、in vivoの解析結果を踏まえて、in vitro由来卵母細胞のRNA-seq解析を行う。
2）in vitro培養系の開発 非成長期卵母細胞から成熟卵を産生した報告は、国内外を通して一例しかなく、20年間、どの研究グループにおいても再現されていない。今年度、構築した成長期卵母細胞のIVG系をさらに発展させるために、新生仔マウス由来の非成長期卵母細胞より個体発生可能な成熟卵の産生を試みる。培養条件として、高分子化合物、血清、代替血清、成長因子などの添加を検討し最適な培養条件の確立を目指す。また、1）の解析の為の試料をどのようなin vitro系で作出するか検討する。
3）卵のインプリント機構解明 卵で付与されるインプリントのためのエピジェネティック修飾がDNAメチル化のみで十分か否か明らかにするため、メチル化インプリントを保持する成長中期卵母細胞と成熟卵で受精卵を作出し、それぞれのインプリントを評価する。
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| Remarks |
現在、作製を検討中です。
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[Journal Article] Production of fertile offspring from oocytes grown in vitro by nuclear transfer in cattle.2013
Author(s)
Hirao Y, Naruse K, Kaneda M, Somfai T, Iga K, Shimizu M, Akagi S, Cao F, Kono T, Nagai T, Takenouchi N.
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Journal Title
Biology of Reproduction
Volume: 89
Pages: 1-11
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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