2004 Fiscal Year Annual Research Report
複数のキナーゼ活性を同時観察可能な蛍光プローブ分子の開発と細胞周期解析への応用
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04J11499
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
河合 康俊 東京大学, 大学院・理学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | 蛍光プローブ / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 緑色蛍光タンパク質 / MAPキナーゼ / Erk / タンパク質リン酸化 / 可視化 / FRET |
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| Research Abstract |
MAPキナーゼファミリーの一員であるErkはさまざまな増殖因子や発がんプロモーターなどの細胞外刺激で活性化されるセリン/スレオニンキナーゼである.本研究ではErkのキナーゼ活性を蛍光顕微鏡下の単一細胞で可視化分析するための新規蛍光プローブ分子の開発を行った.このプローブ分子は,Erkのリン酸化標的基質ペプチドである基質ドメイン,リン酸化された基質ドメインと結合するFHA2ドメイン,およびオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質の変異体であるシアン色蛍光タンパク質(CFP),黄色蛍光タンパク質(YFP)から構成されており,活性化Erkによってリン酸化された基質ドメインがFHA2ドメインと結合することに伴いCFP-YFP間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)効率が変化することを期待して,プローブ分子を設計した.まず,タンパク質からなるこのプローブ分子をコードするcDNAを作製し,培養細胞に導入して蛍光顕微鏡下で観察したところ,細胞から蛍光が観察され,プローブ分子が発現したことが確認された.この細胞に細胞外刺激として上皮細胞増殖因子(EGF)を添加したところ,FRET効率が減少することを見いだした.ウエスタンブロッティング法によりプローブ分子の基質ドメインがリン酸化されていること,また,Erkの活性化を阻害する薬剤U0126の存在下ではFRET効率の減少,基質ドメインのリン酸化ともに観察されないことから,このプローブ分子はErkの活性化を生細胞内で検出することができるものである.
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