2005 Fiscal Year Annual Research Report
siRNA発現ベクターライブラリーを用いた紫外線誘導アポトーシスネットワーク解析
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04J11610
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
カシム V 東京大学, 大学院・工学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | RNAi / siRNA発現ベクター / siRNA発現ベクターライブラリー / 紫外線誘導アポトーシス / micro RNA / micro RNAプロセッシング / siRNAターゲットサイト / 遺伝子の断片 |
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| Research Abstract |
本研究では、siRNA発現ベクターライブラリーを用いて、有用な新規機能遺伝子を網羅的に同定することを目指している。今回は、紫外線誘導アポトーシスにおける関連遺伝子、そしてmicroRNA(miRNA)のプロセッシングにおける関連遺伝子の探索を試みた。紫外線誘導で炎症関係のサイトカインであるTNF-αとIL-1αの上昇を検出する系を立ち上げたが、siRNA発現ベクターの導入によりTNF-αの上昇が影響を受け、検出が難しくなる等の問題があった。また、HeLaS3細胞は紫外線を直接浴びない子宮癌由来の細胞であるため、現在、ヒトのヒフ系細胞を探し、既に持っているA431(ヒト由来の上皮ヒフ癌細胞)と一緒に導入効率等の条件を検討している。紫外線の研究と平行して行っているmiRNAプロセッシングに関わる遺伝子の探索に関しては、miRNA 21の形成に対する影響をノザンブロッティングで検出するスクリーニング系を構築した。ポジティヴコントロールであるDicerに対するsiRNAを導入すると成熟なmiRNAの量が減少し、miRNAのprecursorが蓄積されているのを確認できた。現在、より簡易なファーストスクリーニング系を検討している。今後、どのような遺伝子がmiRNAの転写、primary miRNAからprecursor miRNA、更に成熟なmiRNAになる過程に影響を与えるかをsiRNA発現ベクターライブラリーでスクリーニングを行う予定である。
一方、RNAiを応用する時の問題点である標的配列を実験的に選択するため、私は標的遺伝子の断片を用いた標的配列スクリーニング系を開発し、DsRedとGFPの強いsiRNA標的配列を得ることができた。これに関する研究は、The Journal of Gene Medicineに報告され、現在、オンライン発表された。
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