2005 Fiscal Year Annual Research Report
無細胞DNA複製再開系を用いた損傷DNAの複製フォーク後退メカニズムの解析
Project/Area Number |
05J00870
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
菅野 毅治 大阪大学, 生命機能研究科, 特別研究員(DC1)
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Keywords | DNA複製 / 複製フォーク後退 / DNA損傷 / 複製中間体 / 原子間力顕微鏡 |
Research Abstract |
本研究では、DNA損傷などにより進行を阻害されたDNA複製を再開する機構のひとつと考えられる複製フォーク後退機構を明らかにすることを目的としている。本年度はその為に、細胞抽出液を用いて、SV40 Origin dependent in vitro DNA replication systemにより、試験管内で損傷DNAを合成させる実験系を最初に構築した。この実験系において、紫外線照射により形成される最も主要なDNA損傷であるCPD(cyclobutane pyrimidine dimer)を効率的に乗り越えるDNAポリメラーゼPolηに欠損を示すXP-V細胞抽出液を用いて、CPDを部位特異的に一箇所のみもつプラスミドDNAを複製させることで、高頻度にDNA複製を阻害するようにした。続いてDNA複製中間体の検出が可能なneutral-neutral two-dimensional agarose gel electrophoresis(2D gel)法によって複製中間体を解析したところ、CPD誘発的に生成される複製中間体があることが明らかとなった。 さらにHeLa細胞抽出液と紫外線照射により生じるもうひとつの主要なDNA損傷である6-4光産物を部位特異的に一箇所のみもつプラスミドDNAを用いて、同様の実験を行った。その結果、6-4光産物誘発的に生成される複製中間体が存在することも明らかとなった。
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