生物工学的手法に基づく組織指向性医薬資源の開発と応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470503
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 伊藤 孝司 徳島大学, 薬学部, 教授 (00184656)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑原 淳 徳島大学, 薬学部, 助教授 (90225318)
• Keywords: 遺伝性酵素欠損症 / 保護タンパク質 / カテプシンA / ガラクトシアリドーシス / セリンカルボキシペプチダーゼ / エンドセリン1 / ジーンターゲッティング / 組織指向性細胞株 / トランスジェニックマウス

Research Abstract

遺伝子疾患、特に遺伝性酵素欠損症の治療にとって、正常な遺伝子あるいは酵素タンパク質を患者の障害組織にいかに選択的にかつ効率良く導入・発現させるかは重要な課題である。本研究では組織指向性医薬品の開発を目的として研究を進めており、今年度は下記の成果を得た。
1 保護タンパク質/カテプシンA(PPCA)は、リソソーム内で糖質加水分解酵素の活性を制御する保護機能と、エンドセリン1(ET-1)などの一群の生理活性ペプチドを分解するセリンカルボキシペプチダーゼ活性を併せ持つ多機能性糖タンパク質である。ガラクトシアリドーシス(GS)は、PPCA遺伝子の変異の基づき、これらの酵素の複合欠損を伴い、中枢神経障害をはじめとする全身性症状を示す常染色体劣性遺伝病である。今年度はGSにおけるPPCAのET-1分解活性の欠損に着目してET-1に対する免疫組織化学的解析を行い、GSの各脳組織の神経細胞やグリア細胞ではET-1が細胞型特異的に過剰に蓄積していることを初めて明らかにした。
2 正常ヒト神経系由来培養細胞を用いた病態モデル系を確立する目的で、PPCA対立遺伝子を選択的に破壊するために、ゲノムPPCA遺伝子の第5エキソン内にloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子とその下流に終止コドンを含むターゲッティングベクターの構築を行った。
3 病態モデルマウスの細胞治療法の開発をめざし、当該遺伝子のキャリアーとしての組織指向性細胞株のドナーとして、マーカーとなる緑色蛍光タンパク質(EGFP)および細胞不死化遺伝子を恒常的に発現するトランスジェニックマウス(Tgマウス)を作成するためのトランスジーンを構築した。すなわちユビキタスな発現プロモーターの下流にloxP配列で挟まれた温度感受性SV40T抗原遺伝子、さらにその下流に独立に翻訳されるEGFP遺伝子を連結した遺伝子を作製した。来年度、Tgマウスを作製する予定である。

Research Products

• [Publications] Kohji Itoh: "Abnormal distribution of endothelin-1 in the cerebellum affected by galactosialidosis."Annals of Neurology. 47. 122-126 (2000)
• [Publications] 伊藤孝司: "保護タンパク質/カテプシンAおよびリソソーム性シアリダーゼと遺伝性代謝異常症"生化学. 72. 1160-1164 (2000)
• [Publications] Yasunori Naganawa: "Molecular and structural studies of Japanese patients with sialidosis type 1."Journal of Human Genetics. 45. 200-206 (2000)
• [Publications] Kyoko Takiguchi: "Structural and functional study of K453E mutant protective protein/cathepsin A causing the late infantile form of galactosialidosis"Journal of Human Genetics. 45. 241-249 (2000)