立体構造に基づく高度好熱菌ヌクレオチド除去修復の反応機構の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780472
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 増井 良治 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40252580)
• Keywords: DNA修復 / ヌクレオチド除去修復 / UvrB / UvrA / 高度好熱菌 / 表面プラズモン共鳴 / 蛋白質間相互作用

Research Abstract

我々のグループは,その蛋白質が安定で立体構造解析や分子機能解析に適した高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として,原核生物のヌクレオチド除去修復系酵素群の研究を進めてきた。そして最近,X線結晶解析によりUvrBの立体構造の決定に成功した。その立体構造および他種ホモログとのアミノ酸配列の保存性から推定したUvrA結合ドメイン(βドメイン;154〜242残基目)だけをヒスチジンタグ融合蛋白質として大腸菌で発現させ,精製した。さらに,このUvrB-βと配列類似性を示すtranscription-repair coupling factor(TRCF)のβドメインも同様に発現・精製した。まずネイティブ電気泳動で2つのβドメインとUvrAとの相互作用を調べたところ,相互作用が確認された。次に,表面プラズモン共鳴法によりこの相互作用を定量的に調べたところ,両者とも全長のUvrBと同程度の親和性でUvrAに結合できることが分かった。また,全長のUvrB(実際に用いたのはATP加水分解活性を欠失したUvrBの変異体)は結合に伴ってUvrAのATP加水分解活性を阻害するが,βドメインでは阻害しなかった。そこで,UvrAとUvrBの複合体にβドメインを加えたところ,UvrBによる活性の阻害が抑制された。これらのことから,UvrB(およびTRCF)のβドメインがUvrA結合ドメインであることが強く示唆された。

Research Products

• [Publications] Yuri Kil: "Efficient strand transfer by the RadA recombinase from the hyperthermophilic archaeon Desulfurococcus amylolyticus"Journal of Bacteriology. 182(1). 130-134 (2000)
• [Publications] Maria Spies: "The RadA protein from a hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum is a DNA-dependent ATPase that shows two disparate catalytic modes, with a transition termperature at 75℃"European Journal of Biochemistry. 267(4). 1125-1137 (2000)
• [Publications] Atsushi Yamagata: "Interaction of UvrA and UvrB proteins with a fluorescent single-stranded DNA"Journal of Biological Chemistry. 275(18). 13235-13242 (2000)
• [Publications] Ryuichi Kato: "Observation of RecA protein monomer by small angle X-ray scattering with synchrotron radiation"FEBS Letters. 482(1-2). 159-162 (2000)
• [Publications] Shigeyuki Yokoyama: "Structural genomics projects in Japan"Nature Structural Biology. 7(11,supp). 943-945 (2000)