立体構造に基づく高度好熱菌ヌクレオチド除去修復の反応機構の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780472
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 増井 良治 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40252580)
• Keywords: ヌクレオチド除去修復 / 高度好熱菌 / Thermus thermophilus / 転写共役修復 / UvrB / UvrA / 蛍光標識DNA / ATP加水分解

Research Abstract

本研究では,その蛋白質が安定で立体構造解析や分子機能解析に適した高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として,ヌクレオチド除去修復系酵素群の研究を行った。まず我々が決定したUvrBの立体構造に基づき,UvrAとの相互作用部位と考えられるβドメインを単独で発現・精製し,表面プラズモン共鳴法やUvrA ATP加水分解活性に対する効果によって,UvrAとの結合活性を調べた。その結果,UvrBのβドメインはUvrAとの主要な相互作用部位であることを明らかにした。また,UvrBにはβドメイン以外の領域もUvrAとの結合に関わっており,βドメインによる結合に引き続いて,ATP依存的な過程を経て,より強固な結合が形成される可能性が考えられた。次に,転写共役修復過程においてUvrAと相互作用することが知られているtranscriptio -repair coupling factor(TRCF)遺伝子のクローニングを行った。UvrAに対するUvrBとTRCFの関係を調べるため,TRCFのβ相同領域についても単独で発現・精製を行い,同様の解析を行った。その結果,UvrAとの結合に関して,TRCFのβドメインはUvrBと競合することが判明した。このことはTRCFのβ相同領域がUvrA結合ドメインであることを示しており,さらにTRCFが障害部位にUvrAを導いたのち,UvrBと競合する形でUvrAから解離する可能性が示唆された。障害DNAとの結合に関しては,蛍光標識DNAを用いた結合反応の解析から,UvrBが結合した後にDNAがゆるやかにコンフォメーション変化を起こすことが示唆された。

Research Products

• [Publications] 増井 良治: "酸化傷害DNAの修復機構"蛋白質核酸酵素. 46(11). 1618-1624 (2001)
• [Publications] 中川 紀子: "高度好熱菌のDNA修復蛋白質UvrBの構造と機能の関連"蛋白質核酸酵素. 46(8). 968-975 (2001)
• [Publications] Shigeyuki Yokoyama: "Structural genomics projects in Japan"Nat. Struct. Biol.. 7(11). 943-946 (2000)
• [Publications] Atsushi Yamagata: "Interaction of UvrA and UvrB proteins with a fluorescent single-stranded DNA Implication for slow conformational change upon interaction of UvrB with DNA"J. Biol. Chem.. 275(18). 13235-13242 (2000)
• [Publications] Noriko Nakagawa: "Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 UvrB protein, a key enzyme of nucleotide excision repair"J. Biochem.. 126(6). 986-990 (1999)
• [Publications] Akihiro Shibata: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a DNA excision repair enzyme, UvrB, from Thermus thermophilus HB8"Acta Crystallogr.. D55(3). 704-705 (1999)