2002 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子ホーミング・エンドヌクレアーゼと長鎖DNAとの複合体の構造生物学研究
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13033005
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐藤 能雅 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (30150014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水谷 隆太 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482)
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| Keywords | 遺伝子ホーミング / エンドヌクレアーゼ / 二本鎖DNA / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / DNA複合体 / 酵素複合体 / スプライシング |
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| Research Abstract |
酵母のVMA1遺伝子がコードするVMA1蛋白質からプロテインスプライシングで生ずるエンドヌクレアーゼVDEは,自らのVDE遺伝子を欠くVMA1ΔVDEを認識して切断し,VDE遺伝子を挿入する遺伝子ホーミングを引き起こす。本研究では,VDEが認識する長鎖の二本鎖DNAとVDEとの複合体のX線結晶構造解析を行い,DNAの認識とエンドヌクレアーゼによる切断反応の機構を明らかにし,遺伝子ホーミング現象の構造生物学的な理解を得ることを目的とした。
研究の2年度では,回折能が良好な,19塩基長と31塩基長のDNA鎖から成る二本鎖DNAとVDEの複合体の結晶について,シンクロトロン放射光を用いてX線回折強度データを収集し,複合体の全体構造を結晶学的な最小二乗法により精密化した。
結晶構造では,VDEと二本鎖DNAは各々1分子づつで複合体を形成していること,DNAは19塩基対長に渡って二本鎖を形成し,VDEのドメインIとドメインIIIの広い分子表面の領域で接触していることが判明した。DNA切断部位はVDEのドメインIにあり,このエンドヌクレアーゼ活性部位では,用いたDNAは一本鎖となっていること,さらに,酵素の活性部位はAspやLysなどの活性残基のセットが2組が対になっていることなど,二本鎖DNAの認識と切断に関する詳細な三次元構造知見を得ることができた。
VDEを生ずるプロテインスプライシング反応とエンドヌクレアーゼ活性の関係を調べるため,スプライシング反応の進行を遅くした変異体を種々発現させ,精製,結晶化し,そのうちの2種類の構造をX線解析により明らかにした。その結果,スプライシング反応の初期ステップ,反応とエンドヌクレアーゼ活性のサイトは異なる領域であることを明らかにできた。また,黄色ブドウ球菌カセットリコンビナーゼ2種の発現,精製と結晶化を研究では行った。
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[Publications] R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y.Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Protein-Splicing Reaction via a Thiazolidine Intermediate : Crystal Structure of the VMA1-Derived Endonuclease Bearing the N and C-Terminal Propeptides"J. Mol. Biol.. 316. 917-927 (2002)
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[Publications] S.Nogami, T.Fukuda, Y.Nagai, S.Yabe, M.Sugiura, R.Mizutani, Y.Satow, Y.Anraku, Y.Ohya: "Homing at an Extragenic Locus Mediated by VDE (PI-SceI) in Saccharomyces cerevisiae"Yeast. 19. 773-782 (2002)
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[Publications] R.Mizutani, T.Tsuchida, H.Yuzawa, T.Ito, K.Hiramatsu, Y.Satow: "Expression, Purification, and DNA-Binding Assay of a Staphylococcal Cassette Chromosome Recombinase CcrA"The 6^<th> Interncational Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections. 99 (2002)
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[Publications] R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y.Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Crystal Structure of Spliceable Precursors of Yeast VMA1-Derived Homing Endonuclease"Acta Crystallographica. A58S. C108 (2002)
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[Publications] S.Miyamoto, R.Mizutani, Y.Satow: "Crystallographic Studies on Yeast Homing Endonuclease VDE in Comlex with Double-Stranded DNA Substrates"SPring-8 Experiment Report. 9. 204 (2002)
