2001 Fiscal Year Annual Research Report
アクチン調節タンパク質ゲルソリンの細胞内機能のリアルタイムバイオイメージング
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13670001
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤田 寿一 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助手 (30212187)
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| Keywords | ゲルソリン / GFP融合タンパク質 / バイオイメージング |
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| Research Abstract |
アクチン調節タンパク質ゲルソリンは、重合核形成によるアクチン線維伸長の促進(Nucleating)、アクチン線維の切断(Severing)およびその末端の保護(Capping)という3つのアクチン重合調節機能を持つ。これらの活性はカルシウムにより正に、ホスファチジル・イノシトールリン脂質によって負に制御されており、ゲルソリンは厳密に調節されたこれらの両面性の機能を通じて重合-脱重合という両局面を制御して、細胞運動において重要な役割を担っていると考えられている。ゲルソリンの細胞内局在に関しては、間接蛍光抗体法や、蛍光プローブで標識したゲルソリンをマイクロインジェクションして観察した得られた結果が報告されているが、生きた細胞内で活性化され、機能しているゲルソリンを可視化した報告は、まだされていない。本研究では、メンブラン・ラッフリングといったダイナミックな形態変化を伴う細胞運動において細胞内で実際に機能しているゲルソリンの動態を蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer ; FRET)を応用し、可視化することを目的とする。
平成13年度は、第一段階として、オワンクラゲの蛍光タンパク質GFPの誘導体であるECFPとEYFPを、N末端とC末端にそれぞれ融合したマウス・ゲルソリンの発現ベクターを構築して、リポフェクション法により細胞内へ導入し、その発現を抗マウス・ゲルソリン抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。現在、この融合タンパク質を大腸菌の系で発現する発現ベクターも構築し、その大量発現およびその精製により、in vitroにおいてゲルソリンの機能を保持しているかどうか、またカルシウムやホスファチジル・イノシトールリン脂質、あるいはアクチンとの相互作用により、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による蛍光波長のシフトが生じるかを、さらに検討中である。
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