2001 Fiscal Year Annual Research Report
難治性深在性真菌症における薬剤耐性メカニズムと新しい治療法に関する研究
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13670462
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
宮崎 義継 長崎大学, 医学部・付属病院, 講師 (00311861)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 茂 長崎大学, 大学院・医学研究科, 教授 (80136647)
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| Keywords | クリプトコッカス / 抗真菌薬 / アゾール |
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| Research Abstract |
(1)ターゲット分子の配列確認:アゾール耐性C. neoformans株NUCR1148株および感受性株NUCR1147の14-apla-demethylase(アゾールの標的分子)をコードするERG11遺伝子を増幅し、そのPCR断片のシークェンスを確認する。野生型(感受性株)と耐性型のアミノ酸配列の比較を行なった。その結果、484番目のグリシンがセリンに替わる遺伝子変異を見出した。
(2)クローニング:確定された変異を有するERG11のORF(open reading frame)を含むcDNAのサブクローニングを行った。NUCR1148株(耐性)およびNUCR1147株(感受性)から、それぞれERG11遺伝子のcDNAを、GALプロモーターを有するベクターに組み込み、それぞれpCN48EG11およびpCN47EG11とした。
(3)形質転換による表現型(感受性)の確認:pCN48EG11およびpCM7EG11を用いて、Saccharomyces cerevisiae DKS1株のtransformationをおこなった。ガラクトースとグルコースによる発現のオン・オフを調節できるため、組み込んだERG11の配列の違いによる薬剤感受性を調べた。プロモーターオフの状態では、変異の有無による薬剤感受性の変化はみられなかったが、ガラクトース添加によりプロモーターOnにすると、S48Gの変異を有する形質転換株でフルコナゾールMICの有意な上昇(2μg/ml→8μg/ml)が認められた。
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