抗細菌性タンパク遺伝子導入によるin vitroでの細菌感染抑制効果

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671907
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 賀来 亨 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60133253)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254) ; 中島 啓介 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (80227785) ; 安彦 善裕 北海道医療大学, 歯学部, 助教授 (90260819)
• Keywords: βディフェンシン / マクロファージ / 遺伝子導入 / 細胞死 / アポトーシス

Research Abstract

ヒトβディフェンシン1および2の全長のcDNAをHigh federityの耐熱性DNA polymeraseを用いたPCR法により増幅し、Hygromycin耐性プラスミドpcDNA1.1につなぎ込み、βディフェンシン蛋白発現ベクターを作製した。つなぎ込んだそれぞれの遺伝子のcDNA配列をシークエンスにより確認し、全配列がData baseと一致しているものを選択した。この発現Vectorをin vitroでCOS7細胞にlipofection法にて導入して、western blot法にて蛋白の発現を確認した。この蛋白の発現されたVactorを同じくlipofection法にてJ774.1へ遺伝子導入し、Hygromycinによりセレクションを行った。ここで得られた細胞からRNAを抽出して、RT-PCR法によってヒトβディフェンシン1および2mRNAの発現について検索したところ、これらの発現が確認された(hBD-1/J774.1, hBD-2/ J774.1)。この確立された細胞株(hBD-1/J774.1, hBD-2/ J774.1)を用いて、遺伝子導入していない細胞株J774.1をコントロールとして、Actinobacilluce actinomycetemcomitance (Aa)の感染抑制効果について検討した。Aa菌の感染率をstandard quantitative assay (Meyer et al. 1996)にて評価し、細胞死の評価をMTT assay, quantitative DNA fragmentation assayおよび電子顕微鏡的観察により行った。hBD-1/J774.1, hBD-2/ J774.1いずれの細胞でもJ774.1よりもAa菌感染による細胞死率が低下しており、hBD-1、hBD-2遺伝子導入により感染抵抗性の向上が確認された。

Research Products

• [Publications] Abiko Y, Jinbu Y, Noguchi T, Nishimura M, Kusano K, Amaratunga P, Shibata T, Kaku T: "Upregulation of human beta-defensin 2 peptide expression in oral lichen planus, leukoplakia and candidiasis. An Immunohistochemical study"Pathol. Res. Pract.. 198. 537-542 (2002)
• [Publications] Ito Y, Abiko Y, Tanaka Y, Rahemtulla F, Kaku T: "mmunohistochemivcal localization of large chondroitin sulfate proteoglycan in odontogenic tumor"Med Electron Microsc. 35. 173-177 (2002)
• [Publications] Kayama T, Nakade O, Takada Y, Kaku T, et al.: "Melatonin pharmacologic dose increase bone mass by suppressing resorption through down-regulation of the RANKL-mediated osteoclast formation and activation"J Bone Miner Res. 17. 1219-1229 (2002)
• [Publications] Abiko Y, Nishimura M, Kusano K, Nakashima K, Okumura K, Arakawa T, Takuma T, Mizoguchi I, Kaku T: "Expression of MIP-3α/CCL20, a macrophage inflammatory protein in oral squamous cell carcinoma"Archiv Oral Biol. 48(2). 171-175 (2003)