インテグリン依存性P13K-Akt経路を介したケラチノサイト分化機構の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13770454
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 緑川 和重 愛媛大学, 医学部, 助手 (20291502)
• Keywords: P13Kinase / 角化細胞 / 分化 / アポトーシス / サスペンションカルチャー / アデノウィルスベクター

Research Abstract

A) アウィルスベクターの調整
PI3Kの活性型(AxCA Myr-p110)、阻害型(AxCAΔp85)、Aktの活性型(AxCAMyr-Akt)、阻害型(AxCAAkt-AA)、遺伝子組み込みアデノウィルスベクターを293細胞にて大量に増殖させた後、精製・濃縮・透析を行い-80℃にて保存した。
B) PI3K-Akt経路の阻害による角化細胞の分化誘導
AxCAΔp85を培養角化細胞に感染させPI3K活性を阻害すると、分化と考えられる形態変化を示した。また、AxCAΔp85及び、PI3K阻害剤であるLY294002を加えて、PI3K活性を阻害し、分化マーカーの発現をmulti-probe ribonuclease protection assay(RPA)法にて調べたところ、早期分化マーカーであるK1,K10が誘導されており、形態変化とあわせてPI13K活性を阻害すると分化を誘導することが確認できた。
C) サスペンションカルチャーによる分化誘導
Poly-HEMAでコーティングしたカルチャーディッシュを用いて角化細胞をサスペンションカルチャーし、分化マーカーの発現を検討した。Involucrinタンパクの発現はWestern blot法にて検討し、増加しているとをが明らかとなった。また、K1,K10,inbolucrin, loricrin, transglutaminase-1のmRNA発現はRPA法で解析し、増加を確認した。以上より、Poly-HEMAを用いたサスペンションカルチャーで分化を誘導することが確認できた。
D) Aktの活性化の解析
抗Thr308リン酸化特異的抗体、及び抗Ser473リン酸化特異抗体を用いてWestern blot法にてAktの活性化状態を確認したところ、AxCAMyr-p110でAktが活性化されることが分かった。