硝酸イオンシグナル伝達に関与する遺伝子の単離・解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14760038
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 白石 斉聖 神戸大学, 農学部, 助手 (00304121)
• Keywords: 硝酸イオン / 情報伝達 / 遺伝子

Research Abstract

I)外来DNAを導入した硝酸イオン情報伝達系破壊型変異体の作出と選抜
ホウレンソウ培養細胞にパーティクルガンを用い、外来遺伝子(pBlueScript)を導入し遺伝子破壊型変異体を作出した。作出した変異体からクロレートを用いた薬剤耐性により硝酸還元酵素(NR)欠失変異体を選抜した。一次選抜において約2000個体、二次選抜で90個体を得た。これらを液体培地にて培養し、細胞増殖が確認された15個体を解析に用いた。
得られた変異体についてNR活性を測定し、活性の低い14個体を選抜した。次に硝酸イオンによる遺伝子誘導に関与すると考えられているcis配列(AGTCA配列)をGUSレポーター遺伝子に繋いだプラスミドを用い、GUS活性測定により硝酸イオンシグナル伝達の有無を確認した。この結果レポーター遺伝子活性の低い3個体の変異体を選抜した。これら変異体が硝酸イオントランスポーター遺伝子変異体ではないことを確認するため細胞内硝酸イオン含量を測定した。いずれの変異体も細胞内に硝酸イオンを取り込むことを確認した。またNRmRNA、NRタンパク質発現量を測定した結果、いずれの変異体も発現は確認されなかった。
これら3個体についてゲノム遺伝子への外来遺伝子挿入を確認した結果、1個体のみに外来遺伝子の挿入が確認された。
II)破壊された遺伝子断片の単離
選抜した変異体からゲノムDNAを単離しTAIL-PCR法を用いて破壊された遺伝子断片の単離を行った。その結果約500bpと900bpのDNA断片を得た。現在このDNAの解析を行っている。