イヌ膵管組織片の熱可逆性ハイドロゲル内培養による膵内分泌細胞の新生について

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14770631
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 磯貝 晶子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助手 (50318929)
• Keywords: 熱可逆性ハイドロゲル / 膵前駆細胞 / 膵管組織片

Research Abstract

ビーグル系雑犬の膵管のみを摘出し、その組織片(0.5mm^3)を熱可逆性ハイドロゲルポリマー(TGP, thermoreversible gelation polymer)を用いて三次元培養を行い、膵前駆細胞が誘導できる培養系を確立した。しかしこの膵前駆細胞は培養開始4-5週目以後は分裂・増殖を停止したままの状態で、かつ培養を継続しても分化しなかった。この現象はTGPは常に流動性であることより、細胞は接着できない-分化誘導には足場依存性が必要-ことに由来するものと推定した。そこで今年度は膵前駆細胞を培養皿底面に接着させ、さらに分化誘導因子を添加して膵内分泌細胞が形成されるかどうかを検討した。
これまでの方法により、膵管組織片をKGF10ng/ml、HGF10ng/ml、nicotinamide10Mm添加した10%TGF含有RPMI1640液にて三次元培養した。培養6週目培養皿プレートを冷却してTGPを液化した。組織片・細胞集塊を培養皿底面に付着させた後、TGF含有培養液を除去した。新たにHGF40ng/ml、nicotinamide10Mm、ブドウ糖400mg/dl含有RPMI1640を添加して静置培養した。経日的に位相差顕微鏡にて形態観察し、培養後10〜12週目に組織学的に検討した。
付着した組織片・細胞集塊から細胞が散在性に増殖し、4〜6週目には大きさ100〜150μの上皮細胞様細胞集塊が形成された。6〜8週目頃より細胞集塊から細胞が浮遊し、大きさ50μ前後の細胞集塊を形成した。この細胞集塊を集めてinsulin、gulucagon、somatostation染色した。その結果、somatostatin陽性、insulin陰性、gulucagon陰性であった。
このsomato^+/insur^-/gluca^-は膵ラ島の発生過程では、一段階前の集団に属している。