2002 Fiscal Year Annual Research Report
蛋白質の大量発現で形成される封入体の固定核磁気共鳴法による構造解析
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14780502
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
梅津 光央 東北大学, 多元物質科学研究所, 助手 (70333846)
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| Keywords | 封入体 / 蛋白質発現 / 蛋白質巻き戻し / 固体NMR |
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| Research Abstract |
本年度は、まず初めにニワトリ卵白リゾチーム(HEL)を特異的に認識する抗体HyHEL10の一本鎖Fv断片(HyHEL10-scFv)と超好熱古細菌Pyrococcus horikoshii OT3由来蛋白質の大腸菌発現で得られる封入体の構造解析をFT-IRと固体^<13>C NMRスペクトルにより封入体中のαヘリックスとβシート構造比率を求めた。その結果、すべての封入体において何らかの規則配列が形成されていることがわかり、その二次構造の比率は各々の天然型構造のそれと非常に類似していた。このことから、封入体中における発現蛋白質はランダムな構造ではなく天然型に近い二次構造を有していることが示唆された。また、scFvに関してはその封入体形成を考察するために、in vitroでの巻き戻し操作を行い、その過程でおこる蛋白質凝集を観測した。その場合、scFvは可溶状態である程度二次構造を形成していないと不溶の凝集体ではランダムになってしまうことがわかった(梅津他J. Biol. Chem. 278,8979-8987(2003))。これから、封入体はある程度天然型の二次構造をとってから形成されていることが示唆された。
さらにより詳細な封入体の構造解析を行うために、二次元NMR測定も試みた。そのためにまず封入体中におけるアミノ酸の標識法を研究し、その後MAS回転下で双極子-双極子相互作用を効率よく回復させるRFDR法とより遠距離の磁化移動が可能なPDSD(スピン拡散)法を用いた二次元同核種^<13>C-^<13>C相関NMRを測定した。その結果、ValやAlaのCβ・Cγ化学シフト値を観測することに成功し、αヘリックス存在を議論できる結果を得た。現在これから、封入体と天然型構造のより詳細な構造比較を行っている。
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Research Products
(1 results)
