2015 Fiscal Year Annual Research Report
Ｄｌｋ１－Ｄｉｏ３ゲノムインプリント制御領域の分子メカニズムの解明
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14J03234
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
齋藤 剛志 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | インプリント / エピジェネティクス / ゲノム編集技術 / IG-DMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・マウス12番/ヒト14番染色体に存在するDlk1-Dio3ゲノムインプリント領域はヒト疾患の14番のUPD (uniparent Disomy) において責任領域であり、この領域のインプリント状態に異常が生じる事でマウスでは周産期において胎生致死となることから、発生に不可欠な領域であることが分かっている。この領域のインプリントを制御するのはIG-DMRと呼ばれるDlk1-Dio3領域内に存在するインタージェニックな約8kbpの親の由来特異的なメチル化可変領域であることが分かっているが、その機能する際の分子メカニズムは未だ不明瞭な点が数多く存在する。また、既存のゲノムインプリント領域の制御メカニズムとは異なるメカニズムを持っていることが考えられるデータが集まりつつある。本研究では、Dlk1-Dio3領域のインプリント状態を制御するIG-DMRが機能する際の分子メカニズムの解明を目的とする。
・IG-DMR機能領域候補欠損マウスのメチル化解析
昨年度までに種間における配列の保存性を基にIG-DMRの機能領域候補4ヶ所についてそれぞれ父方由来と母方由来で欠損した場合のマウスを作製した。
今年度はこれらのマウスのIG-DMRとそのsecondary DMRであるDlk1-DMR、Gtl2-DMRについてメチル化解析を行った。その結果、IG-DMR特異的タンデムリピートを父方由来で欠損したマウスではIG-DMRとGtl2-DMRでは野生型に比べ優位に低メチル化を示した。また、昨年度よりIG-DMR特異的タンデムリピートのTgマウスの系を確立しており、これらのマウスで同様にIG-DMRにおけるメチル化状態を解析したが、現在のところ野生型と比較して差は見受けられない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度は昨年度に続き、IG-DMRの機能に重要と考えられる4つの機能領域候補をそれぞれ欠損したマウスを雌雄で揃え、それらのマウスをJf1と掛け合わせ雌雄のアレルの区別を可能にした上で各機能領域候補の欠損を父方アレルで受け継いだ場合と母方アレルで受け継いだ場合のマウスを胎生14.5日で2腹ずつ揃えた。またIG-DMR特異的タンデムリピートを含む候補4についてはTgの系を昨年度に複数ライン確率しており、継代を重ね雌雄でTgマウスを得た。これらのマウスとC57BL/6を掛け合わせ胎生14.5日胚を採取し解析予定である。Tgマウスについては未だ全て揃え終えていないが、残りの作製したマウスについて、IG-DMRと周辺のDMRについてメチル化解析を行いTgマウス以外の系統に関しては全てメチル化解析を終え、IG-DMR特異的タンデムリピートの欠損を父方アレルより受け継いだ場合、インプリントの制御が崩れIG-DMRとGtl2-DMRで低メチル化を示す事が明らかとなった。現在は主にこれらのマウスでDlk1-Dio3領域周辺のインプリント遺伝子の発現状態の解析を行っている。また当初の計画には存在しなかったが、IG-DMR特異的タンデムリピートが機能に重要である事が明らかとなったことに加え、近年の報告でIG-DMR特異的タンデムリピートにZFP57が結合し、これがTRIM28等と複合体を形成しGtl2の制御に関与する事が示唆されている。IG-DMR特異的タンデムリピートを父方由来で欠損した際の表現型の主因がZFP57である可能性を考慮し、これを検討するためタンデムリピート内に存在するZFP57のbinding motif五ヶ所を置き換えたマウスをゲノム編集技術により作製中である。IG-DMR機能領域の同定に留まらず、その具体的なメカニズムの候補まで見えてきた事で、当初の予定より大きく進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
胎生14.5日胚で揃えたIG-DMR機能領域候補について、Dlk1-Dio3領域周辺のインプリント遺伝子の発現状態の解析を行い、メチル化解析の結果とあわせて、各機能領域候補におけるIG-DMRにおける役割を評価する。また、作成中のIG-DMR特異的タンデムリピートのTgマウスとC57BL/6を掛け合わせた胎児を取り、同様にメチル化解析を行いIG-DMR特異的タンデムリピートのみでインプリントの機能が保持されるのか解析する。またIG-DMR特異的タンデムリピートに結合する因子ZFP57がIG-DMRによるインプリントの制御において重要な機能を有している可能性を考慮し、IG-DMR特異的タンデムリピートに存在するZFP57のbinding motif5ヶ所を置き換え、ZFP57がIG-DMR特異的タンデムリピートに結合しないマウスをゲノム編集技術を用いて作製し、このマウスでIG-DMR特異的タンデムリピートを父方由来で欠損した場合のマウスの表現型が再現するか解析する。また、これまでにIG-DMR特異的タンデムリピートを含みながらIG-DMR内約3 kbpを欠損したマウスでは母方由来に欠損を受け継いだ場合周産期致死を引き起こすが、父方由来に欠損を引き継いだ場合正常に出生し、成長する事が報告されており、当計画のこれまでの成果と照らし合わせるとIG-DMR特異的タンデムリピート以外にもIG-DMRの機能領域が存在する可能性が考慮される。そこで、IG-DMR特異的タンデムリピートを含むカタチでIG-DMR内を2分割する様に欠損するマウスをゲノム編集技術を用いて作製し、さらなるIG-DMR機能領域の探索を目指す。
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Research Products
(2 results)
