真核細胞の翻訳制御の分子レベルでの解析:再構成翻訳開始系を用いて

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15030242
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 今高 寛晃 独立行政法人理化学研究所, タンパク質大量発現・精製研究チーム, 上級研究員 (50201942)
• Keywords: 翻訳開始 / 翻訳開始因子 / 翻訳 / 再構成 / 複合体 / 真核細胞翻訳開始

Research Abstract

真核細胞翻訳開始の再構成を進めるため、複数のサブユニットから構成されているeIF2(eukaryotic initiation factor 2)eIF2B, eIF3,を大腸菌や昆虫細胞よりリコンビナント体(組み換え体)を得ることにした。
eIF2:α,β,γの三つのサブユニットから構成されている。これら三つのユニットを同時に発現するバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞に感染させ複合体を細胞内で作らせる試みを行った。精製はニッケルカラムやフラッグカラム(γユニットにHisまたはFLAGタッグが付加されている)、そしてイオン交換を含む通常の精製法を用いた。まだ活性のある精製品は得られていない。認知された問題点はγユニットのほとんどが不溶性となることと、βユニットが非常に壊れやすいという点であった。また、大腸菌において三つのユニットを発現させeIF2複合体を精製しているが同様の問題点が生じている。
eIF2B:1,2,3,4,5の五つのサブユニットから構成されている。二つのバキュロウイルスを用いてすべてのサブユニットを同時発現させた。精製は成功し(95%以上の精製度)活性も再構成翻訳系を用いて確認された。
eIF3:9から12のサブユニットから構成されている。三つのバキュロウイルスを用いて特に重要と推測した九つのサブユニットを同時発現させた。極微量の複合体と考えられる精製品が得られたが、活性は存在していなかった。まず、三つのバキュロウイルスを同時に同じ細胞に感染させるのは、ウイルス同士が競合するため困難であり、最大サブユニットであるp170のほとんどが不溶性になることが問題点である。また、残りの3つのサブユニットが複合体形成に必須なのかも知れない。