DNA複製因子の機能解析からウイルス増殖制御機構解明へ向けて-ヒト体細胞株での相同組換えを利用したアプローチ-

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659109
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 吉田 健一 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員(常勤形態) (20345036)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井ノ上 逸郎 東京大学, 医科学研究所, 客員助教授 (00192500)
• Keywords: DNA複製 / 相同組み換え / 細胞周期 / 癌 / Geminin / MCM7

Research Abstract

・Gemininのdestruction boxをノックアウトした細胞株の樹立
Geminin遺伝子のdestruction box領域を特異的にノックアウトする目的で、前後にloxP配列を付加したネオマイシン耐性遺伝子(Neo)を持つノックアウトベクターを作製した。ヒト大腸癌細胞HCT116に導入し相同組み換え体(+/-)を同定し、Creリコンビナーゼ酵素でNeoを除去(+/loxP)し、再度、+アレルでの相同組み換え体を得た(-/loxP)。得られた細胞(wild type,+/-,-/loxP)についてmRNA・タンパク発現量、細胞増殖性、DNA複製能、細胞周期のFACS解析、EBV OriPからのDNA複製能およびヌードマウス皮下移植による造腫瘍性について検討した。
・ドキシサイクリンによりMCM7をコンデショナルに発現可能な細胞株の樹立
HCT116細胞にテトラサイクリン制御性トランス活性化因子をコードするpTet-offベクターおよびC末端にFLAGタグを付加したMCM7をコードするpTRE2-Hygベクターを導入し、ドキシサイクリンによりMCM7-FLAGの発現レベルを調節可能な細胞株を作製した。この細胞を用いてMCM7の細胞周期に対する影響、EBV OriPからのDNA複製能およびヌードマウス皮下移植による造腫瘍性について検討した。
研究成果
Gemininの細胞周期依存的タンパク分解に重要なdestruction boxがヒト細胞において、EBV OriPからのDNA複製と造腫瘍性に重要であることを証明した(Oncogene 23:58-70:2004)。
Geminin・Cdt1の下流に位置するMCM7の発現増強がGeminin同様、EBV OriPからのDNA複製と造腫瘍性に関与することを明らかにした(FEBS Letters 553:213-217,2003)。

Research Products

• [Publications] Yoshida, K., Inoue, I.: "Conditional expression of MCM7 increases tumor growth without altering DNA replication activity"FEBS Letters. 553. 213-217 (2003)
• [Publications] Yoshida, K., Oyaizu, N., Dutta, A., Inoue, I.: "The destruction box of human Geminin is critical for proliferation and tumor growth in human colon cancer cells"Oncogene. 23. 58-70 (2004)