新規シグナル分子単離を目指した遺伝学的スクリーニング法の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659118
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 黒崎 知博 関西医科大学, 医学部, 教授 (50178125)
• Keywords: 劣性遺伝子 / DT40 / 変異 / アッセイ系 / GFP遺伝子 / ノックイン

Research Abstract

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchickenDT40細胞において、chromosomeのcetromere,telemere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を特異的にdeletionすることが可能である。既にこの方法を用いてchickenに存在するchromosomeの1、2、3のdeletion作成した。
次にchromosome dessectionにより、1、2、3のchromosomeのgenomic bank (約20-50kb/clone)をつくり、その際in vitroで化学変異源を用いそれぞれのgenomic cloneに変異をいれると同時に哺乳類薬剤markerであるneo遺伝子を導入した。
一方、DT40細胞のアッセイ系をGFPで光学的に容易に検出できるようシステムを構築した。Bcl-2遺伝子は、NF-KB径路により強く制御されているので、Bcl-2遺伝子プロモーター領域にGFP遺伝子をノックインの方法を用いて導入した。実際、NF-KB径路を活性化するシグナルをこの細胞に加えるとGFPの顕著な上昇が認められ、システムとして用いることができることを判明した。
又、このBcl-2/GFPを導入したDT40細胞を用いて、変異を導入し、かつneo遺伝子を導入したgenomic bankをトランスフェクションして約1000個のクローンを得た。

Research Products

• [Publications] Kurosaki, T.: "Checks and balances on developing B cells."Nat.Immunol.. 4. 13-15 (2003)
• [Publications] Yamazaki, T., Kurosaki, T.: "Contribution of BCAP to maintenance of mature B cells through c-Rel."Nat.Immunol.. 4. 780-786 (2003)