C型肝炎ウイルスコア蛋白と結合するDNA修復酵素の遣伝子クローニング

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659176
• Research Institution: Department of Clinical Research, National Hospital Organization Nagasaki Medical Center
• Principal Investigator: 石橋 大海 国立病院長崎医療センター, 臨床研究センター, 臨床研究センター長 (80127969)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 八橋 弘 国立病院長崎医療センター, 臨床研究センター, 治療研究部長 (50360855) ; 中村 稔 国立病院長崎医療センター, 臨床研究センター, 先端技術研究部長 (40217906)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / HCVコア蛋白 / DNA修復酵素 / 遺伝子クローニング / 肝発癌機構 / DNA修復機構関連蛋白 / 哺乳類細胞発現ベクター / 肝細胞癌

Research Abstract

本研究は、C型肝炎ウイルスコア蛋白と結合するDNA修復酵素の遺伝子クローニングを試みるものである。C型肝炎ウイルス(HCV)の感染により、肝炎の慢性化、さらに長い年月を経て肝硬変、肝癌へと進展していくことが明らとなり、HCVの持続感染が肝細胞の癌化に深く関わっていると推察されているが、肝発癌機構については、未だ十分に解明されていない。最近では、HCVコア蛋白が発癌過程に関与する様々な宿主因子と相互作用してC型慢性肝炎からの発癌を誘導する可能性が提唱されているが、HCVとDNA修復酵素との相互作用についての詳細な検討はなされていない。そこで本研究は、HCV-コア蛋白がDNA修復機構関連蛋白と結合し、修復を阻害するという仮説を立て、HCV-コア蛋白と結合する蛋白を遺伝子レベルで網羅的なスクリーニングをおこない、この仮説を検証することとした。
はじめに、HCVコア蛋白をほ乳類細胞中に高発現させ、そのときの宿主細胞におけるDNA修復酵素への影響を調べることとした。HCVはジェノタイプによりさまざまな領域に変異体や特異性があることから、日本人に多い1b患者血清から、HCV-RNAを単離、cDNAを作製し、コア蛋白コード領域をクローン化した。次に、内部配列を確認し、1b野生型のクローンを選択し、哺乳類細胞発現ベクター(tag付き)に挿入した。作製したベクターを培養細胞株に遺伝子導入し、HCV-コア蛋白の発現をWestern blot法で確認したところ、コントロールベクター導入細胞では、tag蛋白の発現が確認できたが、コア蛋白領域を含むベクターでは発現が確認出来なかった。
今後は、他の培養細胞株を用いて、HCVコア蛋白安定発現株の取得を目指すと共に、肝細胞からのcDNAライブラリーの作製に着手する予定である。

Research Products

• [Publications] Kono Y, Hayashida K, Tanaka H, Ishibashi H, Harada M.: "High-density lipoprotein binding rate differs greatly between genotypes 1b and 2a/2b of hepatitis C virus."Journal of Medical Virology. 70(1). 42-48 (2003)
• [Publications] Dohmen K, Shigematsu H, Irie K, Ishibashi H.: "Comparison of the clinical characteristics among hepatocellular carcinoma of hepatitis B, hepatitis C and non-B non-C patients."Hepatogastroenterology. 50(54). 2022-2027 (2003)
• [Publications] Dohmen K, Shigematsu H, Irie K, Ishibashi H.: "Clinical characteristics among patients with hepatocellular carcinoma according to the serum levels of alpha-fetoprotein and des-y-carboxy prothrombin."Hepatogastroenterology. 50(54). 2072-2078 (2003)
• [Publications] Nomura H, Tanimoto H, Sou S, Nagahama T, Hayashi J, Kashiwagi S, Ishibashi H.: "Pilot study of prolonged interferon-alpha retreatment in chronic hepatitis C patients with genotype 1b."Hepatology Research. 27(4). 266-271 (2003)
• [Publications] Nomura H, Sou S, Nagahama T, Hayashi J, Kashiwagi S, Ishibashi H.: "Efficacy of early retreatment with interferon beta for relapse in patients with genotype Ib chronic hepatitis C."Hepatology Research. 28(1). 36-40 (2004)
• [Publications] Yoshida H, Tateishi R, Arakawa Y, Sata M, Fujiyama S, Nishiguchi S, Ishibashi H, Yamada G, Yokosuka O, Shiratori Y, Omata M: "Benefit of interferon therapy in hepatocellular carcinoma prevention for individual patients with chronic hepatitis C."Gut. 53(3). 425-430 (2004)