2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04318
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 穣 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土原 一哉 国立研究開発法人国立がん研究センター, 先端医療開発センター, 分野長 (00415514)
山下 理宇 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 准教授 (10401259)
河野 隆志 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (80280783)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マルチオミクス解析 / シングルセル解析 / ガン細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、単一細胞レベルの解析に応用可能な転写開始点解析、エピゲノム解析（オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析）手法の基盤技術開発を行う。今年度行った技術基盤開発から、ATAC法を援用する形式で、単一細胞エピゲノム解析が可能となった。また転写開始点解析についても試行的実験には成功しており、現在、その再現性およバルク細胞を用いた手法とのデータの互換性についての検証を行っている。
実際に開発された系を用いて、実際に肺腺癌培養細胞における遺伝子発現制御の多様性についての解析を行った。PC9細胞をはじめとする６種類の細胞株について、単一細胞エピゲノム解析を行ったものである。先行研究において単一細胞トランスクリプトーム解析から見出された細胞間での多様性は、転写制御領域でのオープンクロマチン形成の多様性としても反映されていた。見出されたそれぞれの階層での多様性がどのように相互に関連しているのか、トランスクリプトームレベルで細胞間多様性の高い遺伝子とオープンクロマチンレベルでのそれとの比較等、現在、さらに詳細は解析を進めている。また、それぞれの細胞びドライバー変異に対応する分子標的薬を作用させ、発現多様性の観点からその薬剤応答性についての観察も開始した。
一方で、単一細胞メチル化解析については、微量化についての基礎実験が難航している。シークエンス鋳型を調整するために効率的な工程の確立を依然として模索している状況である。これについては次年度以降の課題として素反応課程の検証から再検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
単一細胞におけるオープンクロマチン解析については、フリューダイムC1システムを援用する形式で反応系を開発、実装し、実際にデータ産生に至ることができた。６種類の肺腺癌細胞種について100細胞での単一細胞エピゲノムデータを取得した。これらについてバルク細胞との比較を行ったところ、良好な再現性と一致率で計測を行うことができていることが確認された。開発された反応系は、申請者らが別途行っている技術提供の枠組みの中で研究者コミュニティに提供すべく、現在、対象とする課題の選定を行っている。多様な系での応用を通じて、さらに頑強なシステムを構築できると考えている。
転写開始点解析については、C1システムでの実装に先立って、外部試験管の系での微量化についての検討を行った。Clontech社の提供するSmarter Systemを用いることで、効率よく転写開始点近傍の配列を取得することが可能となった。確立されたプロトコールをC1システム上に実装し、鋳型の調整を行い、シークエンス解析を進めている。得られる結果について、別途作成したバルク細胞からの解析結果と転写開始点位置、発現量についての異同を比較解析する予定である。
単一細胞オープンクロマチン構造解析については、開発された方法論を用いて実際のデータ取得を開始した。現在までに収集された肺腺癌由来細胞株における単一細胞オープンクロマチン解析結果から、トランスクリプトーム上で見られた細胞間での発現多様性は、そのプロモータ領域でのオープンクロマチン形成の点でも反映されていることが確認された。現在、細胞間での遺伝子発現の多寡がその転写制御領域のオープン構造について、どの程度相関するのか、またその多様性が抗がん剤刺激によりどの程度、変化するのかについて関連データの取得を完了しており、解析を開始したところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
単一細胞における多層オミクス解析技術の解析について、今年度中にはほとんどの反応はC1システムにおいて実装が完了できると考えている。ただし、単一細胞DNAメチル化解析については、少数細胞を用いたバルク細胞での反応系からも十分な鋳型調整を行うことができなかった。バイサルファイト反応後のゲノムDNAの回収効率が悪いことが主な原因と考えられるが、現在、トランスポゾン挿入反応を用いたゲノムDNAの断片化の過程ををより均一かつ完全に行うように条件設定を改善することにより問題の解決に努めようと考えている。
また、その他のオミクス解析については、順次、データ産生を開始する。肺腺癌培養細胞から初めて、その細胞間多様性を遺伝子発現制御の観点から詳細に解析する。また臨床検体について、本計測系を用いるべく付帯条件の整備を行う。臨床検体については、組織から単一細胞への分離が大きな課題となる。マウス組織をモデル系に用いて、collagenase等を用いたいくつかの分離条件を試み、開発された手法が援用可能であるかについて検証を進めるものとする。予備的実験が良好に機能した場合、国立がん研究センターにおける分担研究者が現在選択を進めている多様性の観点から興味深い症例について、単一細胞解析を行う予定である。
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Research Products
(11 results)
