2016 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of translational regulatory mechanism by RNA-protein complex
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15H04358
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
船津 高志 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00190124)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | １分子生理学・生化学 / １分子イメージング / ナノ計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．miRNAによる遺伝子発現の制御
蛍光標識を施したpre-miRNAをマイクロインジェクション法により細胞内に導入した。生細胞内におけるmiRNA可視化技術と一分子検出イメージング法を用いて、miRNAの生合成過程と細胞内局在について調べた。蛍光イメージング・FCSからmiRNA生合成過程の特徴を捉えた。まず、ループ構造を有したpre-miRNAのみが細胞内での残存率が高く、また導入直後から成熟化まで継続的に複合体に取り込まれていたことから、複数の段階から成る内在性の生合成過程は共役して機能していることが示唆された。また、生合成過程におけるpre-miRNAの二本鎖解離過程の時定数を決定した。2種類のpre-miRNA (let-7a-1とmiR-21)について二本鎖解離過程の時定数はともに約40分だった。さらに、miRNAの局在が細胞骨格を利用した移動によりなされていることを発見した。
２．ストレス顆粒（SG）による遺伝子発現の制御
SG内でmRNA一分子の運動を解析するために、蛍光色素の明滅を応用した新規のmRNA一分子追跡法を開発した。ローダミン誘導体である2MeSiRがチオール存在下で明滅を示すことを見出し、励起光条件を検討した結果、生細胞内でmRNA一分子の追跡に成功した。この手法を用いてSG内の内在性GAPDH mRNAの一分子運動解析を行った。各軌跡の平均二乗変位を求め、運動様式を自由拡散、制限された拡散、静止に分類した。SG内GAPDH mRNAの運動様式の割合を調べたところ、60%が静止している一方で、制限された拡散が25%、自由拡散が15%という割合で存在し、SG内mRNAの運動には不均一性があることが分かった。mRNAがSGs内で何らかの構造に繋ぎ止められ動きが制限されていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．miRNAによる遺伝子発現の制御
固相合成したmiRNAに単に蛍光色素を付けただけではmiRNAの機能が発揮されず、蛍光標識したpre-miRNAを用い、細胞内で成熟miRNAに変換することで活性を持ったmiRNAを得ることができた。ループ構造を有したpre-miRNAのみが細胞内での残存率が高く、また導入直後から成熟化まで継続的に複合体に取り込まれていた。この実験系を用いて、生合成過程におけるpre-miRNAの二本鎖解離過程の時定数が40分であることを明らかにした。miRNAの局在がアクチンフィラメントを始めとする細胞骨格を利用した移動によりなされているということを発見した。生細胞内で細胞骨格上をmiRNAが動いている様子を直接観察したのは本研究が初めてである。来年度以降は、核内におけるmiRNAの交通網の存在を明らかにしたい。
２．SGによる遺伝子発現の制御
超解像観察の結果、SG内でmRNAは密度差をもって分布し、顆粒内部で高密度領域を形成して分布していることを明らかにしたことは大きな成果である。また、蛍光色素の明滅を応用した新規のmRNA一分子追跡法を開発することができた。これによって、SG内でmRNAのダイナミクスを捉えることができるようになった。超解像で明らかになったSG内のmRNAの高密度領域とｍRNAの運動の関係を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．miRNAによる遺伝子発現の制御
一分子蛍光イメージングにより細胞内におけるmiRNAの局在がアクチンフィラメントを始めとする細胞骨格を利用した移動によりなされていることを発見した。細胞質内でクラスターを形成したmiRNAがゴルジ体を中心に集積、離散していた。細胞骨格を介したmiRNAのゴルジ体との関与を明らかにしたい。さらに、miRNA配列選択的なエキソソームへの封入がゴルジ体で行われている様子をmiRNAの動きとして観察する予定である。核内に移行するmiRNAについては、その存在自体は知られているが、核内へ移行するメカニズムや核内での機能については明らかとなっていない。核内miRNAの標的mRNAとの会合の有無などを調べることで、核内miRNAの機能を明らかにできると期待される。
２．SGによる遺伝子発現の制御
蛍光色素の明滅を応用した新規のmRNA一分子追跡法を開発することができた。これを用いて、SG内の内在性GAPDH mRNAの一分子運動解析を行う。SGの形成を促すストレスとして0.5 mM sodium arseniteが多用されているが、細胞の生存率が低いこと、ストレスを解除した後にSGが消滅する細胞の割合が少ないという問題点がある。これを解決するために、細胞にヒートショックをかけてSGを形成することを試みる。超解像で明らかになったSG内のmRNAの高密度領域とmRNAの運動の関係を検討する。また、ナノメートルスケールの局在・運動の情報を元に、SGを構成するタンパク質とmRNAの相互作用解析など更なる解析を行い、SGの持つ翻訳抑制機構の解明を達成したい。
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