2016 Fiscal Year Annual Research Report
チューブリンアイソタイプの網羅的機能解析によるマルチ－チューブリン仮説の検証
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15H04369
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
杉本 亜砂子 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (80281715)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | C.elegans / 微小管 / チューブリンアイソタイプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I.線虫α-、β-チューブリンアイソタイプの網羅的な発現・機能解析: 昨年度に引き続き、各チューブリンアイソタイプ遺伝子について、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて遺伝子破壊株、および、GFP/mCherry標識株を作製した。α-チューブリン、β-チューブリンアイソタイプ破壊株・標識株をそれぞれ5遺伝子、5遺伝子について得たので、得られた遺伝子破壊株について、胚発生・孵化後発生・運動能力に着目して表現型解析を行った。GFP/mCherry標識株を用いて、各チューブリンアイソタイプの発現時期・発現組織・細胞内局在を高分解能スピニングディスク型共焦点顕微鏡によって解析した。その結果、TBB-1, TBB-2, TBA-1, TBA-2は多様な組織で発現していたが、MEC-12、MEC-7、TBA-4は特異的な神経細胞で、また、TBA-7は腸で発現していることが示された。
II. 線虫チューブリンアイソタイプ間の互換性解析による『マルチ-チューブリン仮説』の検証: 初期胚で発現しているTBB-1, TBB-2, TBA-1, TBA-2について、蛍光標識株を用いて、それぞれの分裂期微小管(動原体微小管、星状体微小管、中央紡錘体)への取り込まれ方に相違点がないか否かを高分解能ライブイメージングによって解析した。また、各チューブリンアイソタイプの発現量・比率を変化させた場合に、微小管動態に変化が生じるかを、伸長する微小管プラス末端に結合するGFP::EB1マーカーのライブイメージングによって定量的に解析した。以上の解析により、それぞれのアイソタイプが微小管動態の多様性に寄与していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
15種類のチューブリンアイソタイプのうち、10種類について遺伝子機能破壊株および蛍光タンパク質標識株を作成し、順調に解析を進めている。チューブリンアイソタイプの発現量・発現部位操作についても、実験手法を確立したので、継続的に解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
I.線虫α-、β-チューブリンアイソタイプの網羅的な発現・機能解析: 引き続き、各チューブリンアイソタイプ遺伝子について、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて遺伝子破壊株、および、GFP/mCherry標識株を作製する。28年度までにα-チューブリン、β-チューブリンアイソタイプ破壊株・標識株をそれぞれ5遺伝子、5遺伝子について得たので、29年度は残りのα-チューブリン4遺伝子、β-チューブリン1遺伝子について破壊株・標識株の構築を行う。得られた株を用いて、表現型解析および発現時期・発現組織・細胞内局在解析を行う。同一細胞で複数のアイソタイプが発現されている場合には、細胞内局在部位の違いについても着目して解析を行う。
II. 線虫チューブリンアイソタイプ間の互換性解析による『マルチ-チューブリン仮説』の検証: 各チューブリンアイソタイプを異所的に発現させた場合に、微小管動態に変化が生じるかを、伸長する微小管プラス末端に結合するGFP::EB1マーカーのライブイメージングによって定量的に解析する。とくに神経特異的に発現しているアイソタイプを初期胚で強制発現した場合の微小管動態に着目して解析する。以上の解析により、チューブリンアイソタイプの微小管動態の多様性への寄与を体系的に明らかにする。
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