2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04615
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
荒川 圭太 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (00241381)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福士 幸治 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60218906)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 過冷却 / 氷核タンパク質 / 氷核形成阻害 / ポリフェノール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、過冷却促進ポリフェノール類が氷核物質による水溶液の凍結を阻害するメカニズムを明らかにするため、過冷却促進ポリフェノールと同様に氷核物質についても理解を深め、過冷却促進物質によって氷核物質の活性を阻害するメカニズムの解明を目指すことにした。そのため、氷核細菌Erwinia ananasから単離したinaA遺伝子を大腸菌で発現させて得られた氷核タンパク質inaAを利用してモデル実験を構築し、過冷却物質と氷核物質との相互作用の可能性を検証することを本研究の主たる目的のひとつとした。
まずは、ヒスチジンタグを付したinaA（His-inaA）を発現させた組換え大腸菌の氷核活性を熱分析法で測定し、E. ananas細胞の活性と比較した。E. ananasでは、サンプル容量が2マイクロリットル中に100,000個の細胞を含む懸濁液が-4.8℃で凍結したのに対して、組換え大腸菌では2マイクロリットル中に1,000個の細胞を含む懸濁液が-5.1℃で凍結した。細胞密度ベースで比較すると組換え大腸菌では100倍近く低い濃度でE. ananasと同程度の氷核活性を示したことや、コントロール（His-lacZを発現する組換え大腸菌の懸濁液）が-25℃付近で凍結することを考慮すると、組換え大腸菌ではHis-inaAによる氷核活性が十分発現しているものと推察された。しかし、大腸菌体内ではHis-inaAが封入体に蓄積されていることも考えられるため、E. ananasにおけるinaAと同様の性質（局在性、構造、活性）を示すのか否かについて調べる必要がある。また、氷晶結合ドメインに対する特異抗体を調製したところ、E. ananas と組換え大腸菌の双方でinaAと同様の大きさを持つバンドが検出されること確認できたので、今後、氷核活性における氷晶結合ドメインの重要性を検証したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、氷核細菌E. ananasから単離したinaA遺伝子を大腸菌で発現させて得られた組換え氷核タンパク質His-inaAを利用してモデル実験系を構築し、過冷却物質と氷核物質との相互作用の可能性を検証することを目指した。
これまで過冷却促進ポリフェノール類の活性測定などで氷核細菌を分画せずに利用してきたため、昨年度はHis-inaAを発現する組換え大腸菌をそのまま氷核として利用する条件で実験をおこなった。氷晶形成ドメインに対する特異抗体を調製できたため、これを用いてHis-inaAに対する反応性を調べたところ、inaAタンパク質と同程度のサイズのタンパク質がイムノブロット法によって検出された。次に抗体の反応性を検証するため、組換え大腸菌の懸濁液に特異抗体を添加して、その凍結温度の変化の有無を調べてみることにした。そこでこれまで行ってきた氷核活性の測定方法に準じて菌体を破壊せずに使用した場合、何度も条件検討を繰り返したものの結果のばらつきが解消されず、有意な差として検出できなかった。この原因として、菌体を破壊しないままで使用すると、高濃度に抗体を用いても、抗原であるHis-inaAタンパク質と効率よく反応できるか否かわからないことなどの理由が考えられた。そのため、今年度以降、菌体濃度やサンプル容量、菌体の破壊の有無など、根本的に実験条件を見直していく予定である。また、菌体を使用した実験での評価が難しいか否かにかかわらず、His-inaAの部分精製を試みて、氷核として実験系にどの程度利用できるか検討していきたい。この系が立ち上げられたら、これらのinaA由来の氷核物質に対して過冷却促進ポリフェノールがどの程度、どのような様式で作用するのかについて、熱分析法などを用いて調べていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、氷核タンパク質と過冷却促進ポリフェノールとの相互作用の有無を検証するための実験系を構築するため、１）組換え大腸菌や部分精製した組換え氷核タンパク質His-inaAが氷核としてどの程度利用可能であるかを調べた上で、２）利用しやすいものを氷核に用い、過冷却促進ポリフェノール類による阻害効果を検証する。それに加え、３）氷晶形成ドメインに対する特異抗体の有効性の検証を試みる。実験が順調に進めば、氷核タンパク質と過冷却促進ポリフェノール類との相互作用の解明を進める。
１）組換え氷核タンパク質His-inaAの機能評価： 昨年度は従来法に準じ、His-inaAを発現させた組換え大腸菌の懸濁液をそのまま氷核として利用して解析を試みたが、安定した結果が得られなかったため、今年度は、菌体を用いる場合には菌体濃度やサンプル容量などの条件検討を改めて行う。もしくは、菌体から氷核活性の強い画分を回収し、部分精製したHis-inaAを用いて活性測定し、氷核としての有効性を評価する。もし、十分に使用できることがわかれば、これを用いて実験系を構築する。
２）His-inaAを用いた過冷却促進ポリフェノール類による氷核形成阻害活性の測定： 部分精製したHis-inaAもしくはそれを発現させた組換え大腸菌を氷核に用いて過冷却促進ポリフェノール類の氷核形成阻害活性を熱分析法などで測定し、両者の相互作用の有無を検証するための実験条件を調整する。
３）氷晶形成ドメインに対する特異抗体の反応性の検証： 上記で条件検討した実験系に対して、特異抗体を添加し、氷核活性や氷核形成阻害活性に対してどのような影響があるかについて調べる。それによって条件を絞り込み、氷核タンパク質と過冷却促進ポリフェノールとの相互作用の有無について検証を試みる。
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Research Products
(10 results)
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[Presentation] 樹木由来の氷核活性の検出2015
Author(s)
鉄穴口晃、鈴木伸吾、荒川圭太
Organizer
日本木材学会北海道支部 平成27年度研究発表会
Place of Presentation
旭川地場産業振興センター（北海道旭川市）
Year and Date
2015-11-13 – 2015-11-13
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[Presentation] 交雑ポプラの超低温保存に関する研究2015
Author(s)
川村浩平、嘉見大助、鈴木伸吾、桜井健至、荒川圭太
Organizer
日本木材学会北海道支部 平成27年度研究発表会
Place of Presentation
旭川地場産業振興センター（北海道旭川市）
Year and Date
2015-11-13 – 2015-11-13
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