2016 Fiscal Year Annual Research Report
感染症ゲノム遺伝子型迅速診断法の開発と臨床検体での評価
| Project/Area Number |
15H05272
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
山岸 潤也 北海道大学, 人獣共通感染症リサーチセンター, 准教授 (80535328)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | MinION / diagnosis-by-sequencing / 網羅的診断 / 感染症 / ウイルス / 原虫 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
各種感染症も対する最適な治療方針の提供や病原体拡散のモニタリングにおいて、遺伝子型の判別は重要であり、それを可能とする迅速な検査方法の確立が望まれている。我々は、小型迅速、使い捨てを特徴とする次世代シーケンサーであるMinIONの評価を進めている。また、デング熱、チクングニア熱、マラリア等、熱帯感染症の流行地であるインドネシア共和国マナド市のサムラトランギ大学医学部と研究協力関係を維持している。そこで本計画においては、LAMP法とナノポアの組み合わせによる迅速遺伝子型判別系の現地実証試験を、マナド市で取得した臨床検体で行うことを主題とする。２年目にあたる平成２８年度は、マナド市において熱帯熱マラリア、あるいは四日熱マラリアと診断された患者の血清を収集し、18S rRNA遺伝子のマラリア共通配列を標的としたLAMP 法により増幅した。当初予定していた次世代シーケンサーMiSeqに替え、小型で持ち運び可能な最新式のMinIONで増幅配列の解析を行うことで種の同定を行った。続いて、熱帯熱マラリア特異遺伝子（pfcrt）を標的としたPCRの結果と比較することで、正しく判定できていることを確認した。また、増幅したpfcrtは次世代シーケンサーMiSeq によるマルチプレックスシーケンシングにより配列を解析し、薬剤耐性の有無を確認した。一方、LAMP試薬の乾燥化について条件検討を進めた。特に、これまで手作業で行っていた乾燥化を、バイオインクジェットプリンターを用いることで、均質な乾燥化試薬を大量に準備することに成功した。これにより、今後想定される現地での実装に必要な条件の１つが達成された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記のように、LAMP法により対象遺伝子を増幅し、MinIONで配列解析を行うことで、極めて迅速に種の同定が可能であることを実証した。具体的には、１）マラリア原虫18S rRNA保存配列を標的としたLAMP反応を行いその増幅産物をMinIONで解析することで種を判別すること、デングウイルスの血清型特異的配列を標的としたLAMP反応を行いその増幅産物をMinIONで解析することで血清型（に相関する遺伝子型）を判別すること、３）チクングニアウイルスE1配列をPCRで増幅しその増幅産物をMinIONで解析することで遺伝子型を判別することが可能なことを実証した。さらに、LAMP試薬の乾燥化についても条件検討を進め、当初計画に含まれていなかったインクジェットプリンターを用いた乾燥化の機械化による大量供給にも目途をつけた。一方、研究計画に記載したアルテミシニン耐性に関与するとされるK13-propellerの遺伝子型解析については遅れが生じている。ただし、迅速診断系の開発という本研究課題の実施については、上記の通り他の遺伝子を標的に着実に進展している。したがって、これらの総合的に判断し、本研究計画は順調に進捗していると判断する。
|
| Strategy for Future Research Activity |
H29年度は、高熱等の身体異常を訴え来診した患者のうち診断のつかなかったケースを想定し、その原因を非特異的な核酸等温増幅とナノポアを組み合わせた網羅的解析系によって特定する系の開発を試みる。まずは、ラボでの予備実験として、牛胎児血清に精製デングウイルスを加えた疑似血清を作成し、非特異的な核酸等温増幅を可能とする系の確立を行う。増幅反応は、ランダムプライマー、ダイマーの生成を抑制するためのnot so random プライマー、あるいは、環状化＋phi２９によるローリングサイクル増幅の利用を想定している。その後、臨床検体を用いた実証試験を進める。また、医療機関において通常の検査業務に用いられた検体を匿名化し２次利用を行うことで、各々の患者からインフォームドコンセントを取得すること無しに、すなわち、医療現場への負荷を極力減らすワークフローが可能かどうか調整する。
|
Research Products
(1 results)
