2016 Fiscal Year Annual Research Report
葉緑体Stromuleの細胞内3次元構造の構築と塩ストレス耐性との関連性の解明
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15H05613
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山根 浩二 近畿大学, 農学部, 講師 (50580859)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | イネ / 塩ストレス / 電子顕微鏡 / 葉緑体 / 3次元構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) 葉緑体陥入構造の3次元立体構造の構築
イネ葉緑体陥入構造の連続画像を透過型電子顕微鏡 (TEM)と集束イオンビームSEM (FIB-SEM)を用いて観察した。TEMによる観察から立体構造を構築したところ、陥入構造には以下の3つのパターンが観察された。(1) 陥入構造の両側が閉じられてオルガネラが完全に葉緑体に取り囲まれる型 (Close)、(2) 陥入構造の両端は閉じているが一部に隙間ができる型 (Gap)、(3) 陥入構造の片側が空いている型 (Open)。さらに、FIB-SEMで陥入構造を持つ葉緑体を観察して立体像を構築したところ、葉緑体からシート構造が出現し、そのシート構造がペルオキシソームの一部を取り囲んでいる像が観察された。これらの結果から、葉緑体陥入構造は、葉緑体からシート状構造が出現し、それが他のオルガネラを取り囲むことで構築されることが予想された。さらに、GapやOpenタイプの陥入構造は、シート構造がオルガネラを取り囲む途中の像、または閉じた陥入構造が再び開いた像であることが予想された。
(2) 陥入構造の形成を引き起こす要因
植物に対する塩ストレスの影響は、イオンストレスと浸透圧ストレスの複合である。そこで、ポリエチレングリコール (PEG)を用いて、これまで葉緑体陥入構造が観察された塩濃度 (100 mM NaCl)と同程度の浸透圧ストレスをイネに処理した。その結果、PEGによる浸透圧ストレスだけでも陥入構造が観察されたことから、塩ストレスによる陥入構造の形成は、浸透圧の影響が強いことが示唆された。
クロロフィル蛍光測定装置を用いて様々な値を示す部位を固定し、ウルトラミクロトームで連続切片を作製して葉緑体を観察した。最大量子収率の値が低下するほど葉緑体突起構造が大きくなる傾向にあったが、陥入構造の形成数が増える傾向は観察されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の研究において、FIB-SEMによって迅速に良質な連続画像を取得と立体像の構築の手法を確立することができた。本年度は、その技術を用いて陥入構造を持つ葉緑体の撮影に成功し、立体像の構築まで終えることができた。これまでは、Stromuleがミトコンドリアやペルオキシソームなどのオルガネラを取り囲んで陥入構造が形成されると予想されていた。しかし、本研究により、葉緑体はシート状構造を構築し、その構造を利用して他のオルガネラを取り囲むことが判明した。この構造は、未だ報告されていない新規の葉緑体突起構造であると考えられ、大きな成果を得ることができた。
これまで、葉緑体突起構造であるProtrusionやStromuleは、他のオルガネラとの協調関係を強化する役割が提唱されている。本研究で発見されたシート構造は、他のオルガネラを取り囲む役割をしていることから、これまで提案されている葉緑体突起構造の役割を裏付ける一つの証拠が得られたと考えられる。
陥入構造が形成される条件を調べたところ、ポリエチレングリコールによる浸透圧ストレスだけでも構造が形成されたことから、浸透圧による影響が陥入構造の形成に深く関与していることが示唆された。クロロフィル蛍光測定装置を用いて、葉緑体内のエネルギー状態と陥入構造の形成との関係を調べたところ、最大量子収率が大きくなると葉緑体突起構造であるProtrusionの形成程度が大きくなったが、陥入構造の形成との関係は得られなかった。今後、他のパラメーターとの関係を調べ、葉緑体内のエネルギー状態と陥入構造の形成との関係を明らかにしていく必要がある。
以上のことから、予定していた研究を十分に遂行することができ、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 細胞内における葉緑体の体積や表面積の定量
FIB-SEMの正確な切削を利用し、得られた像から細胞内の体積や表面積を算出する。塩ストレスを受けると、イネ葉肉細胞の葉緑体の多くがシート状構造を形成するため、細胞内に占める葉緑体の体積や表面積の割合は増加すると仮定できる。そこで、塩ストレス下で形成されるシート状構造の体積や表面積を算出することで、細胞内において定量的に有意な形態変化であるかを調べ、耐塩性への貢献を推定する。
(2) イネ葉肉細胞内の陥入構造の形成数の測定とオルガネラ配置の観察
ウルトラミクロトームの切削技術の向上により、イネの葉肉細胞全体を観察することができるようになった。この技術を利用し、1つの葉肉細胞に含まれる全葉緑体に対する陥入構造を持つ葉緑体の割合を算出する。さらに、クロロフィル蛍光測定装置で測定した部位を固定したサンプルを用い、その部位の陥入構造を持つ葉緑体の割合を算出し、葉緑体内のエネルギー状態と陥入構造の形成との関係を明らかにする。また、塩感受性品種である日本晴と耐塩性品種であるPokkaliの陥入構造の形成程度を比較することで、陥入構造と耐塩性との関係を明らかにする。
陥入構造にミトコンドリアやペルオキシソームなどのオルガネラが取り囲まれるためには、葉緑体の近傍にそれらが配置される必要がある。塩ストレス下において、葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソームが密着することは、協調関係を強化して塩ストレスに耐えるためにも重要であると考えられている。これまでの研究により、ストレス下ではこれら3つのオルガネラが密着することは観察されてきたが、3次元的なオルガネラ配置は明らかにされていない。そこで本研究では、塩ストレス下における葉緑体に対するミトコンドリアとペルオキシソームの配置変化を3次元的に調べ、耐塩性との関係を調べる。
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Research Products
(4 results)
