ヒトES細胞からの分化誘導システムを用いた小児固形腫瘍発生モデルの開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09651
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 梅田 雄嗣 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80397538)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ES細胞 / 小児固形腫瘍 / 神経堤細胞

Outline of Annual Research Achievements

ヒト多能性幹細胞であるES細胞から多くの小児固形腫瘍の起源である神経堤細胞（NC細胞）およびその分化細胞を選択的に増殖する培養システムを用いて、（1）小児固形腫瘍の発生モデルの開発（2）本発生モデルを用いたがん幹細胞の出現様式に基づくがん発生メカニズムの解明と新規治療開発を行った。
未分化ヒトES細胞を無血清培養条件下でNodal/activinインヒビター（SB431542）を投与すると、分化6日目にCD271強陽性のNC細胞が全培養細胞の50~80%で検出された。リアルタイムPCRでは、得られたNC細胞はNC細胞の発生・生存（FOXD3）、ニューロンやメラニン産生細胞への分化(SOX10)、軟骨や骨への分化（SOX9）に関連した遺伝子が高発現していた。続いてNC細胞をSB431542+ bFGF存在下で培養すると、CD271陽性CD73陽性でSOX9のみ発現が維持された骨・軟骨前駆細胞が選択的に増殖された。さらに、SB431542 で分化誘導したES細胞に分化3日目からGSK-3インヒビター（CHIR99021）を投与すると、分化6日目に神経系ガングリオシドGD2を高発現している交感神経系様前駆細胞が高頻度に認められた。
ヒトES細胞からNC細胞またはその分化細胞の分化誘導過程においてNC細胞の発生・分化に関連した細胞表面抗原の発現を継時的に解析したところ、CD271・CD73・CD146・GD2を高発現した細胞が認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の主目標の一つはヒトES細胞からの小児固形腫瘍発生モデルに用いる神経堤細胞由来の分化誘導方法の確立と得られた分化細胞の表現型の検討である。昨年度の検討では、未分化ヒトES細胞を無血清培養条件下でNodal/activinインヒビター（SB431542） 、GSK-3インヒビター（CHIR99021）、bFGFなどを添加して培養することにより、NC細胞やその分化細胞（骨・軟骨前駆細胞および交感神経系様前駆細胞）を選択的に分化誘導することが可能となった。また、増殖した細胞についてはリアルタイムPCRによりNC細胞の発生・生存・分化に関連した遺伝子発現が確認できた。
また、本研究における最大の目標は小児固形腫瘍の発生モデルを用いた小児固形腫瘍共通の細胞表面抗原をターゲットとした抗体治療などの新規治療の開発である。昨年度の検討では、ヒトES細胞からNC細胞またはその分化細胞の分化誘導過程においてNC細胞の発生・分化に関連した細胞表面抗原の発現を継時的に解析したところ、CD271・CD73・CD146・GD2を高発現した細胞が認められた。今年度以降はこれらの候補の中から小児固形腫瘍がん幹細胞特異的な細胞表面抗原を抽出し、小児固形腫瘍に共通して使用出来るマウスモノクローナル中和抗体の作成を目指していく予定である。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度の検討で明らかとなった結果を元に、今年度以降は以下の研究を推進して行く予定である。
(1)ヒトES細胞から選択的に増殖させたNC細胞やその分化細胞に対して、 INI1やPhox2Bなどの遺伝子欠損はノックダウン、EWS-FLI1やPAX3/7-FOXO1などのキメラ融合遺伝子はノックインにて遺伝子異常の再現を試みる。遺伝子導入したNC細胞や分化細胞のin vitro増殖能、in vivo腫瘍形成能を検討スクリーニングする。(2)ヒトES細胞由来の分化細胞の遺伝子導入前後におけるCD271・CD73・CD146・GD2の発現を継時的に解析し、候補となる小児固形腫瘍がん幹細胞特異的な細胞表面抗原を抽出する。候補の細胞表面抗原については遺伝子導入後に陽性・陰性細胞に選別し、in vitro増殖能、in vivo腫瘍形成能を比較検討する。腫瘍が発生した場合は2～3ヶ月後に摘出し、病理組織検査・FISH・PCR検査などを用いて病型を確認する。3)同定された特異的細胞表面抗原陽性の小児固形腫瘍幹細胞が実際に細胞株や臨床検体にも存在するかをフローサイトメトリーまたは免疫染色で確認する。存在した場合は、抗原陽性細胞・陰性細胞に純化して、in vitro増殖能、in vivo腫瘍形成能を比較検討する。4)小児固形腫瘍がん幹細胞特異的な細胞表面抗原に対するマウスモノクローナル中和抗体を作成する。小児固形腫瘍の細胞株や臨床検体に中和抗体を投与し、in vitro・in vivoにおける抗腫瘍効果を検討する。