ユビキチンシステムによる破骨細胞制御機構

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591501
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 横内 雅博 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80359976)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 協司 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (50325784) ; 松永 俊二 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (90229500) ; 米 和徳 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (40182844) ; 小宮 節郎 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (30178371)
• Keywords: 破骨細胞 / シグナル伝達 / 抑制因子 / 蛋白分解系 / Src / Cbl

Research Abstract

本研究においてはまず、細胞内蛋白分解系の中心を担っているユビキチンプロテアゾームにおいてE3としての機能をもつと考えられるCblの基質としてのSrcの解析を行った。まず分子生物学的手法を用いて、標識をつけたSrcのdelation mutantを数種類作成した。我々の行っているIn vitro ubiquitin systemではSrcのユビキチン化にはCblとの結合が必要であるため、GSTの標識をつけたCbl蛋白を作成しpull down assayを用いてdelation mutantのSrc蛋白とのin vitroでの結合を調べた。更にSrcのdelation mutantをHEK293細胞内に遺伝子導入し細胞内でのCblとの結合を免疫沈降法にて調べた。次に、Cblと結合し得るSrc mutantのみを使用しSrcのkinase assayを行いSrc mutantのkinase活性の有無を検討した。これらの結果により得られた、Cblと結合可能でありかつkinase活性を保っているSrcのdelation mutantを使用しCblによるユビキチン化の有無を検討した。その結果In vitro ubiquitin systemではいくつかのSrcの領域を欠損させると、CblによるSrcのユビキチン化が起こらないことが分かった。現在更にこのSrc mutantのリジン残基のpoint mutationを作成し、ユビキチン化に必要なリジンの検討を行っている。またこの研究と並行してSrcのN末に結合する新規遺伝子の検索を目的として酵母のTwo-hybrid assayを施行し、幾つかの陽性コロニーが得られており解析中である。