Identification and overcoming specific signals in EGFR-TKI resistant lung cancer

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K09594
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 瀧川 奈義夫 川崎医科大学, 医学部, 教授 (60325107)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山根 弘路 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (50624897) ; 越智 宣昭 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80611615) ; 本多 宣裕 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80746876) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: EGFR / チロシンキナーゼ阻害 / 薬剤耐性 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

マウス由来のIL-3依存性細胞株であるBa/F3にSite-Directed Mutagenesisを用いてプライマーを設計したEGFR-DelE746A750（19Del）、EGFR-L858R変異型（L858R）を作成し、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬（gefitinib、afatinib、osimertinib）の感受性がEGFR野生型を導入したBa/F3細胞株よりもいずれも高くなっていることを証明した。
次に、19Del＋T790二次変異、L858R + T790二次変異、19Del/T790M+C797S三次変異、L858R/T790M+C797S三次変異のベクターを作製（いずれもcis位）し、Ba/F3への導入に成功した。二次変異株ではgefitinibとafatinibには感受性が乏しいが、osimertinibには感受性を残していた。三次変異株では、いずれのチロシンキナーゼ阻害薬も効果がなく、臨床での効果を反映する耐性株を樹立できた。
まず、19Del細胞株とL858R細胞株のタンパク発現の差をみるためにプロテオーム解析を行った。検出された全2517スポットのうち、タンパク質のスポットとして検出されたものは、1155スポットであった。そのうち、差の確認されたものは63スポットあり、内訳として発現が増加したものが44スポット、発現が減少したものが19スポットあった。そのうちピークが明らかに異なるものを切り出し、MALDI-TOF型質量分析システムにより解析した。Mascot（Matrix Science社）検索システムのMS/MS Ion Search法を用いてアミノ酸配列を同定した。スポット1195部位から20個のタンパク、1044部位から19個のタンパク、1106部位から20個のタンパク、1400部位から16個のタンパク、1259部位から20個のタンパク、1111部位から20個のタンパク質を同定した。これらのタンパク質がEGFRのエクソン19とエクソン21変異による下流シグナルの差と考えられるが、その意義について検討中である。