2016 Fiscal Year Research-status Report
C/EBPαの新規Ｃ末端機能領域を介した顆粒球系細胞分化経路の分子機構の解明
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16K09879
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
下川 敏文 日本大学, 医学部, 研究員 (10339327)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 血球分化 / 好中球 / bZIP / タンパク質-タンパク質相互作用 / 酵母ツーハイブリッド法 / ポリコーム抑制複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は，C/EBPαのC末端に同定した新規機能領域に会合する細胞内因子を同定することを目的として，酵母ツーハイブリッド法によってクローニングしたC/EBPαの新規C末端機能領域のインターラクター候補の解析を進め，ポリコーム抑制複合体１（PRC１）の構成因子であるRING1Bを同定した．RING1Bはユビキチン転移酵素として，BMI1とヘテロダイマーを形成してヒストンH2Aを直接モノユビキチン化し，標的遺伝子の転写を抑制すると考えられている．プルダウン解析から，RING1BはC/EBPα変異体CEα-P346Aにも会合でき，C/EBPαのGABPとの相乗的転写活性化には関与しないことが示唆された．C/EBPαが会合する領域を検討したところ，C/EBPαのC末端領域との会合には，RING1B分子のN末端に存在するRINGドメインが必要なことがわかった．RING1BのRINGドメインには，上記BMI1に加え，E2ユビキチン結合酵素が会合する． そこで，RINGドメイン内のC/EBPα会合部位をさらにアミノ酸レベルで同定するため，RING1BのRINGドメイン内の１アミノ酸置換変異体を構築中である．一方，C/EBPαのC末端領域内のRING1B会合部位を検討したところ，GABPとの会合に必要な部位とオーバラップすることがわかった．このことから，C/EBPαとの機能的相互作用に関し，RING1BがGABPに対して競合的に働く可能性が示唆される．
ポリコーム抑制複合体は，クロマチンレベルで転写を制御することにより細胞の分化および発生に必須の役割を担っており，その主要構成因子であるRING1BがC/EBPαの新規C末端機能領域に会合するという知見は，本領域の顆粒球系の特異的遺伝子発現や細胞分化における役割とその分子機構を解明するための大きな足がかりとなることが期待される．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，C/EBPαの新規C末端機能領域に会合する新たな相互作用因子の同定を第一の目標として研究を進めた．その結果，ポリコーム抑制複合体の主要構成因子であるRING1Bが本領域に会合することが明らかとなった．ポリコーム抑制複合体は，クロマチンレベルで転写を制御することにより細胞の分化および発生に必須の役割を担っていることから，今回得られた知見は，C/EBPαの新規C末端機能領域の顆粒球系の特異的遺伝子発現や細胞分化における役割とその分子機構を解明する大きな足がかりとなると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
C/EBPαの新規C末端機能領域のインターラクターとして同定したRING1Bは，ポリコーム抑制複合体を形成して機能することから，研究計画をいくつか変更する必要が生じた．
１．上記したように，C/EBPαの新規C末端機能領域が会合するRING1BのRINGドメインには，ポリコーム抑制複合体の構成因子であるBMI1やE2ユビキチン結合酵素も会合する．そこで，これらの相互作用を保持しかつC/EBPαとの会合能のみが欠損するRING1Bのアミノ酸置換変異体の同定を試みる．
２．C/EBPαとの機能的相互作用に関し，RING1BがGABPに対して競合的に働くかどうかを明らかにするため，RING1Bを細胞に導入し，レポーター解析によりGABP-C/EBPαによる相乗的転写活性への影響を検討する．また，誘導型C/EBPαを導入したK562細胞の安定樹立株（樹立済み；Shimokawa et al. Biochim Biophys Acta 2013）に，同定したRING1Bを強発現，あるいはRNA干渉法によりノックダウンして，好中球分化への影響を検討する．
３．ポリコーム抑制複合体にはいくつかの異性体型が知られている．FcαRやG-CSFレセプター遺伝子などの顆粒球分化のマーカ遺伝子のプロモーターに関し，クロマチン沈降方を用いて，C/EBPαとともに沈降するポリコーム抑制複合体の構成因子を同定することにより，C/EBPαがどの異性体型と会合しているかを明らかにする．
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| Causes of Carryover |
１．酵母ツーハイブリッド法によるインターラクターのスクリーニングが予想以上に順調に進んだため，予定していた試薬や培地が不要になったため．
２．研究成果を発表した学会の開催地が東京近郊だったため，計上した交通費ならびに宿泊費が不要となったため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の未使用額を含めた使用計画は次の通りである．C/EBPαの新規C末端機能領域のインターラクターとして同定したRING1Bはポリコーム抑制複合体の主要構成因子として機能することから，他の構成因子との関連も解析する必要が生じた．このため，これらの発現ベクターを構築するための試薬や抗体の購入に平成28年度の未使用額を使用する予定である．
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