2017 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
17J40150
|
|---|
| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
|---|
Principal Investigator |
有村 奈利子 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所・病態生化学研究部, 特別研究員(RPD)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
|
| Keywords | 中脳 / Dscam / RapGEF2 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの解析で、Dscamが神経細胞移動を制御すること、中脳神経細胞は、興奮性、抑制性神経細胞が同時期に同領域から生まれ移動することや、両細胞種はDscam/RapGEF2/Rap1という共通の分子カスケードを細胞移動開始に必要とすることを明らかにしてきた。本研究課題では、中脳神経細胞移動とDscamによる形態制御という観点から中脳神経細胞の神経細胞分化がどのようになされるかについて解析をおこなった。神経細胞は移動時にダイナミックに形態を変化させる為、移動中の形態に言及するには経時的に観察する必要がある。そこで、中脳神経細胞が生み出される胎生期の半ばE13.5において、子宮内エレクトロポレーション法を用いて中脳背側神経細胞に蛍光蛋白質(核をラベルするヒストン2B-GFPや膜移行型KusabiraOrange [mKO2] 等)を導入し、24-48時間後に中脳スライス培養系のtime-lapse imagingを行って個々の細胞の神経細胞移動を解析した。この時同時にDscamのノックダウンベクターを導入し、Dscamの機能解析を行った。興奮性神経細胞に共通して発現するNeuroDプロモーターを使用して、神経細胞特異的に形態観察を行なった。その結果、分化直後の神経細胞移動を可視化することに成功した。いくつかの特徴的な形態が観察されており、これらを新たに幾つかのグループにまとめて解析した。また、これまでの研究で、Dscamの下流でRapGEF2が機能していると考えられた。また、Dscamのダイマー形成が多い時の方が、結合分子が乖離しやすいことも見出した。さらに、N-cadherinの機能阻害を行うと、Dscamのエンドフィート形成阻害を抑制することから、N-cadherin/β-catenin はDscamの下流で抑制されていることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題で目標にしているDscamによる中脳神経細胞移動の制御機構について一定の成果をあげることができているため、本研究課題は概ね順調に進展していると考えた。具体的には、中脳神経細胞のラベルのためにNeuroD promotorを使用して、神経細胞の形態変化を観察したこと、またこのシステムを利用して、Dscamの機能阻害を行った時に見られる神経細胞の形態変化を他の分裂細胞と分けて解析できたことである。また、RapGEF2やN-cadherin等の相互作用や関連分子の機能阻害を通じて、endfeetの形成や神経細胞の脳室面からの離脱における分子メカニズムの解明しつつある点も順調であると考える点である。さらに、Dscamのホモダイマー形成による下流シグナル伝達の制御については、培養細胞を使用した新たな実験系を立ち上げており、今後のさらなる解析に貢献するであろうと考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）中脳神経細胞移動とDscamによる形態制御
予備的研究により早期神経軸索と後期神経軸索の接触により神経細胞の移動を制御している可能性が示唆されていた。そこで、早期神経軸索を切断して、切断により生じる後期神経細胞の細胞移動の変化を、中脳スライスのtime lapse imagingにより検討する。また、子宮内エレクトロポレーション法にて、胎生期早期のE11.5に蛍光分子を発現させ、さらに後期E14.5の神経細胞に別の色の蛍光分子を発現させて、2色でラベルされた軸索細胞間の接触と移動の開始を経時観察する。Dscamのドミナントネガティブ体を子宮内エレクトロポレーション法にて導入し、細胞移動の異常を検討する。ノックアウトマウスに子宮内エレクトロポレーション法にて、胎生期早期のE11.5にDscamを発現させ、さらに後期(E14.5) 神経細胞にDscamを発現させた場合と発現させていない場合について検討する。
２）Dscamの下流シグナル伝達とダイマー形成による制御
野生型とドミナントネガティブ体の両方を用いた免疫沈降実験を行う。野生型とドミナントネガティブ体の結果を比べることで、細胞外Dscamが提示されダイマー形成を行った時に、どのような細胞内シグナルカスケードが活性化するのかについて明らかにする。
|
