2017 Fiscal Year Annual Research Report
筋ジストロフィー症に対する細胞移植とリハビリテーション介入効果のメカニズム解析
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17J40184
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹中 菜々 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 筋ジストロフィー症 / 細胞移植治療 / リハビリテーション / iPS細胞 / サテライト細胞 / 間葉系前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①DMDマウスに対する細胞移植実験
デュシェンヌ型筋ジストロフィー症（DMD）に対する細胞移植治療については、すでに多くの研究結果が報告されている。しかし、細胞移植による治療効果を運動機能の面から正確に評価された報告はこれまでになかった。そこで、我々は、重度免疫不全DMDモデルマウス（DMD-null/NSG mouse）の運動機能を経時的に正確に評価する方法を確立した。さらに、ヒト不死化筋芽細胞株(Hu5/KD3)を使用した移植実験では、移植細胞に由来するDystrophin陽性筋線維数の増加と比例して、移植肢での最大筋力が改善されることも示した。また、筋ジストロフィー症患者やモデル動物を対象とした先行研究では、DMDの病態を改善するためには、骨格筋全体の10-30％に相当する筋線維でDystrophin発現を回復させる必要があることがわかっている。しかしながら、ヒトに対する移植治療を想定した場合、単純な移植治療だけでそれを達成するには相当数の細胞を投与する必要があり、臨床応用実現性が低い。そこで、より高効率で治療効果を発揮する細胞移植方法の確立を目指し、細胞移植治療の前後にリハビリテーション介入を加えることを考え、現在研究を進めている。
②UCMDマウスに対する細胞移植実験
骨格筋に存在している間葉系前駆細胞（MSC）が産生する6型コラーゲン（COL6）は、骨格筋再生に関与しているとの報告があり、ヒトでは、COL6の欠損はウルリッヒ型筋ジストロフィー症（UCMD）等の筋疾患の原因であることもわかっている。さらに、重度免疫不全UCMDモデルマウス（COL6KO/NSG）に対する移植実験を行ったところ、iPS細胞から作製されたMSC（iMSC）がUCMDモデルマウスに対する移植治療用細胞源として有用であることが明らかとなった。現在は、治療メカニズムの解明を目指し研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①DMDマウスに対する細胞移植実験
平成29年度は、細胞移植の前に、なんらかの運動介入を加えることで、移植効率が向上するのではないかとの仮説に基づき、実験を開始した。その結果、移植の24時間前に、移植を実施する筋に対して経皮的電気刺激を加え、等尺性収縮運動を付加した群では、移植前に運動負荷を加えなかった群と比較して、移植細胞の生着効率（移植を受けた筋を構成する全骨格筋線維に対する、移植細胞由来Dystrophin陽性線維の割合）が約2倍向上するということが確認された。さらに、Evans Blueという色素を用いた実験では、DMD筋の代表的な病態の一つである「筋の脆弱性」が、細胞移植によってDystrophinタンパクが補充された筋線維においては改善されているということも確認できた。この結果を受け、移植前の運動負荷と細胞移植のセットを週に一回の頻度で複数回繰り返すという新たな移植方法を発案し、Dystrophin陽性線維数を格段に増やすことに成功した。この移植方法を用いた個体では、DMDに対する移植治療の目標とされてきた10-30％という移植効率が達成されており、それらの個体においては、移植筋の運動機能改善効果が、長期観察時にも確認できた。
②UCMDマウスに対する細胞移植実験
平成29年度は、iMSC移植による病態改善メカニズムを解明するため、COL6を欠損させたCOL6KO-iPS細胞をCRISPR-Cas9システムにより作成した。その後、樹立されたKO-iPS細胞から誘導されたKO-iMSCと、正常なCOL6分泌能力を持つiMSCとを、それぞれ、UCMDモデルマウスの骨格筋より採取した筋サテライト細胞と共培養し、サテライト細胞の増殖及び分化、さらには、サテライト細胞から分化した筋管細胞の成熟過程に6型コラーゲンが関与していることを、in vitro実験により証明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①DMDマウスに対する細胞移植実験
平成30年度は、平成29年度に新たに確立した移植方法（移植前の運動負荷、複数回移植）に、さらに、移植後の運動負荷も加えることで、治療効果のさらなる向上目指している。平成29年度の実験で、細胞移植によりジストロフィン発現が回復した筋線維では、筋の脆弱性という病態が改善されることが明らかとなっている。そのため、移植治療後のDMDマウスに対して運動負荷を加えた場合は、未処置のDMD筋のように損傷を受けることはなく、むしろ、野生型マウスの筋に運動負荷を加えた場合と同様に、骨格筋肥大・筋力増強といったポジティブな反応が見られるものと考えられる。そこで現在は、細胞移植後のDMDマウスに対する運動負荷条件の検討実験を進めている。また、それと同時に、移植前の運動負荷が移植細胞の生着効率を改善させたメカニズムの解明を目指した実験もはじめている。
②UCMDマウスに対する細胞移植実験
UCMDマウスに対する細胞移植治療効果の、さらに詳細なメカニズムの解明を目指し、iMSC及び、KO-iMSCを用いたin vitro /in vivo両方での実験を引き続き進める。
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