通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18604008
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 松本 知明 Kumamoto University, 大学院・医学薬学研究部, 講師 (30128318)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 勲 八代工業高等専門学校, 情報電子工学科, 教授 (00106113)
• Keywords: 牛乳アレルギー / β-ラクトゲロブリン / 牛乳アレルゲン / 低アレルゲンミルク / 通電処理 / 蛋白結晶化

Research Abstract

試薬に用いたβ-ラクトゲロブリンにはバリアントAとバリアントBが含まれているが分かったので、陰イオン交換クロマトグラフィーによって各バリアントを分離精製した。すなわち、6mlカラムを75mM NaClを20mM Tris-HCl(pH8.0)で平衡してβ-ラクトグロブリンを添加し、NaCl濃度を270mMまで上昇させて各バリアントを溶出させた。この操作を120回繰り返し、β-ラクトゲロブリン試薬10gからバリアントA及びBを2.5g採取した。
各バリアントに通電処理を行い、陰イオン交換クログラフィーで、目的とする陰極側32K蛋白の分離精製を行った。すなわち、6mlカラムを75mM アルギニンを含む20mMTris-HCl(pH8.0)で平衡してバリアントAないしBを添加し、アルギニン濃度を500mMまで上昇させて32K蛋白を溶出した、この蛋白を200mM NaClを含む20mM Tris-HCl(pH8.0)で平衡化したSuperdex75に添加し、ゲルろ過クロマトグラフィー行い、ピーク分画を濃縮し、再度ゲルろ過クロマトグラフィー行った。その結果、バリアンAから1mg、バリアントBから1.3mgの収量が得られ、各々非還元SDS-PAGEで高純度に精製されていることを確認した。さらに動的光散乱測定したところ、各々分散性は15%前後で、結晶化に適した蛋白であることが分かった。現在、エックス線構造解析に向けての蛋白結晶化を行っている。なお、この32K蛋白を用いてβ-ラクトゲロブリン特異的IgE吸着試験を行い、低アレルゲン化されていることを確認した。