2019 Fiscal Year Annual Research Report

脳腫瘍抑制因子Ｌ（３）ｍｂｔによるｐｉＲＮＡ因子転写制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	18J21997
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	山本瞳東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2018-04-25 – 2021-03-31
Keywords	非コードRNA / 生殖細胞 / 転写因子 / 遺伝子発現制御 / 転写制御 / 腫瘍 / 小分子RNA
Outline of Annual Research Achievements	機能性小分子RNAであるPIWI-interacting RNA (piRNA) は、生殖組織特異的に発現し、トランスポゾンの発現抑制によりゲノムの品質管理を行う。piRNA経路はヒトを含む幅広い種で保存されており、piRNA経路の異常は卵形成不全による不妊の原因となるため、piRNA経路の詳細な解明は重要課題である。piRNA経路に必須なPIWIタンパク質を始めとするpiRNA経路因子は生殖細胞特異的に発現するが、体細胞においてはL(3)mbtという脳腫瘍抑制因子により転写抑制されている。そのL(3)mbtを欠失させるとPIWIタンパク質が異所的に発現し、腫瘍化に寄与するという知見がある。そこで本研究は、生殖系体細胞の培養細胞株において、作製したL(3)mbt抗体とゲノムワイドな配列解析を用いて、L(3)mbtによるpiRNA経路因子の転写抑制機構を分子レベルで詳細に解明することを目的とした。本年度は、昨年度に同定したL(3)mbtの新規相互作用因子Xに関する解析を行った。L(3)mbtと同様に、生殖系体細胞においてこの相互作用因子Xの発現を抑制すると生殖細胞特異的なpiRNA経路因子が発現上昇することを示した。発現変動する遺伝子を網羅的に解析したところ、遺伝子群と変動パターン共にL(3)mbtを抑制した時と同様であった。よって、相互作用因子XはL(3)mbtと共同して転写制御に関っていることが示唆された。また、相互作用因子Xのゲノム上局在を解析したところ、L(3)mbtと類似の局在を示しており、ゲノム上で共局在して機能していることが示唆された。今後は相互作用因子Xの網羅的なゲノム上分布の解析とドメイン機能解析を行い、転写抑制機序を考察する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 同定したL(3)mbtに特異的に結合する新規相互作用因子Xについて、発現を抑制した生殖系体細胞のRNAを抽出し、次世代シーケンサーによりRNA-seqを行った。次に得られた配列情報から網羅的な遺伝子の発現量解析を行った。その結果、因子Xを抑制した細胞においてはpiRNA経路因子を含む生殖細胞特異的な遺伝子群が発現上昇していることが示された。また、この遺伝子群の発現変動パターンはL(3)mbtを抑制した細胞における発現変動パターンと類似しており、L(3)mbtと因子Xは共同して生殖細胞特異的な遺伝子群の転写制御に関っていることが示唆された。因子Xに対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降（ChIP）を行い、得られた因子Xに結合していたDNAをChIP-qPCRにより定量した。その結果、因子Xは生殖細胞特異的な遺伝子vasaのプロモーター領域に結合しており、RNA-seqの結果と合わせて考察すると、直接結合することで転写制御を行っていることが示唆された。昨年度に示したように、このプロモーター領域にはL(3)mbtも結合しているため、L(3)mbtと因子Xはゲノム上において共局在して機能していることが示唆される。また生化学的解析により、因子Xを抑制するとL(3)mbtのゲノムへの結合量が減少することや、因子XがL(3)mbtのタンパク質安定性に寄与する可能性が示唆された。よって、因子XはL(3)mbtがゲノム上に安定に存在し転写制御を行う上で重要な機能を果たしていると考えられる。現在、ChIP-seqによる因子Xの網羅的なゲノム上分布について解析を行っており、今後行う予定である因子Xのドメイン機能解析の結果と統合して、転写抑制機序を分子レベルで考察し論文にまとめる予定である。
Strategy for Future Research Activity	L(3)mbtのChIP-seqに加え、現在解析中の同定した新規相互作用因子XのChIP-seq、L(3)mbt、因子Xをそれぞれ抑制した条件下でのRNA-seqの結果を統合して解析を行う。具体的には、L(3)mbtの分布と因子Xの分布の特徴や重複した分布、結合モチーフ、結合箇所近傍に存在する遺伝子群の性質と分類、その発現変動について、解析を行う。次にL(3)mbtと因子Xについての相互安定性やゲノム上分布への貢献、転写制御への寄与をウエスタンブロットやChIP-qPCR等の生化学的実験により評価する。生殖系体細胞において因子Xを抑制し、各ドメインを欠損または一部変異させた因子Xを強制発現させ、piRNA経路因子の異所的な発現変動の変化を解析する。この解析により、転写制御に寄与するドメインを決定する。以上の結果を統合して考察し、論文にまとめて投稿を行う。