2018 Fiscal Year Annual Research Report
Src活性制御の破綻による染色体不安定性を介した細胞のがん化・悪性化機構の解明
| Project/Area Number |
18J22507
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
|---|
Principal Investigator |
池内 正剛 京都薬科大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
|
| Keywords | Src / Hippo経路 / チロシンリン酸化 / blebbing |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
恒常的活性化Srcによる細胞のがん化・悪性化機構の解明を目指し、本研究ではv-Srcが、Hippo経路の一部であるキナーゼに与える影響に着目している。平成30年度には、１）v-Srcによる本キナーゼの直接的なリン酸化が、本キナーゼの活性を低下させること、２）v-Srcによる合成亢進を介して本キナーゼの発現量が増加すること、３）本キナーゼが、細胞膜に局在することでv-Srcによるblebbingを抑制することを明らかにした。
１）In vitroキナーゼアッセイで、本キナーゼがv-Srcの直接の基質であること、さらにはv-Srcによるリン酸化が本キナーゼの活性を低下させることがわかった。
２）本キナーゼの発現が、v-Srcにより継時的に増加したため、その機構を調べた。v-Src非発現細胞において、オートファジー阻害剤やプロテアソーム阻害剤を処理してタンパク質分解系を抑制したが、発現量は増加しなかった。一方、本キナーゼの転写を調節している共役転写因子をノックダウンしたところ、v-Srcによる発現量の増加が抑制され、v-Src発現による本キナーゼの合成亢進が示唆された。
３）細胞の形態を観察した結果、v-Srcによる細胞質突出(blebbing)の有意な増加が観察され、本キナーゼのノックダウンによりさらに増加した。v-Src非発現時、本キナーゼは核内に散在するが、v-Srcの発現時は細胞膜に局在した。本キナーゼは、足場タンパク質を介して細胞膜上に集積するが、足場タンパク質をノックダウンするとblebbingが増加した。これらの結果から、本キナーゼにはv-Srcによるblebbingを細胞膜上で抑制する働きがあると示唆された。v-Src発現細胞では、本キナーゼの発現が増加し、blebbing抑制を介して、v-Srcによる浸潤・遊走を抑制している可能性がある。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、次の５項目（１～５）について取り組む予定であった。各項目の結果及び進捗状況を記す。１）v-Srcによる本キナーゼの機能制御：v-Src発現細胞から集めた本キナーゼとその基質をin vitroキナーゼアッセイした結果、本キナーゼのキナーゼ活性が低下した。２）Srcによる本キナーゼのリン酸化：v-Srcと本キナーゼをin vitroキナーゼアッセイした結果、本キナーゼがv-Srcの直接的な基質であることが示唆された。また、v-Srcによって直接リン酸化された本キナーゼとその基質をin vitroキナーゼアッセイした結果、本キナーゼのキナーゼ活性が低下していることがわかった。３）本キナーゼの局在：v-Src非発現時では、主に核内に散在するのに対し、v-Srcを発現した細胞では細胞膜に局在した。４）Srcが本キナーゼと他の分子との結合に与える影響：本キナーゼを免疫沈降し、本キナーゼとHippo経路構成タンパク質との結合をウエスタンブロッティングで調べた。しかし、内在性レベルでは鮮明な結果が得られなかった。そこで、本キナーゼやHippo経路構成タンパク質を過剰発現させた条件で再度検討する。５）Srcによる本キナーゼの機能抑制を介した染色体不安定性への影響：予備的検討段階ではあるが、本キナーゼをノックダウンしたv-Src発現細胞で二核や多核の細胞が観察された。
その他にも次のような結果を得ている。６）v-Srcにより、本キナーゼの合成が亢進することが示唆された。７）本キナーゼは、v-Srcの発現に伴い細胞膜上へと集積し、v-Srcによるblebbingを抑制していることが示唆された。
以上のことから、平成30年度までの達成度は概ね順調といえる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、次項の解明を目指す。１）v-Srcによる本キナーゼの活性低下機構：Hippo経路は様々なタンパク質から構成されており、構成タンパク質の活性や複合体の形成状態により本キナーゼの活性は変化する。そこで、v-Src発現時に本キナーゼの活性が低下する機構を明らかにするため、Hippo経路の構成タンパク質の活性状態、本キナーゼとの結合の有無や結合量の変化をウエスタンブロッティングや免疫沈降法で調べる。２）本キナーゼのキナーゼ活性に非依存的なblebbing抑制機構：これまでの結果より、v-Srcによるblebbingを抑制する働きは、本キナーゼのキナーゼ活性に非依存的であると推定している。そこで、本キナーゼをノックダウンしたv-Src細胞で観察されたblebbingが、本キナーゼのキナーゼ活性不活化変異体の発現により抑制されるか観察する。３）細胞の遊走・浸潤とblebbingの関係：Srcの活性化によりblebbingが起こること、また転移・浸潤・遊走・アポトーシスなどへのblebbingの関与が報告されている。そこで、本研究で見出したblebbingが遊走や浸潤に寄与するか、ボイデンチャンバーや創傷治癒アッセイを用いて評価する。４）データベースを利用した臨床プロファイルの解析：大腸がんや乳がんなどで、Srcの活性亢進や発現量の増加が報告されている。多次元的ながんゲノミクスデータ解析が可能なWebリソース(cBioPortal for Cancer Genomics)を用いて、臨床データを解析し、Srcと本キナーゼの臨床上での関係性を調べる。
|
