2018 Fiscal Year Research-status Report
光合成電子伝達に必須なチトクロムbc複合体を機能相補する新規電子伝達酵素の同定
| Project/Area Number |
18K06295
|
|---|
| Research Institution | Kanagawa University |
|---|
Principal Investigator |
永島 賢治 神奈川大学, 付置研究所, 研究員 (80264589)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 光合成 / 電子伝達 / シトクロムbc複合体 / 遺伝子操作 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では光合成や酸素呼吸の電子伝達反応において必要不可欠なキノールの酸化と水溶性電子伝達タンパクの還元を行う成分であるシトクロムb6f/bc複合体を機能相補する新規キノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素の生理・生化学的同定を推進した。紅色光合成細菌においてこのような機能を果たすと推定された膜貫通タンパク質複合体にET1と仮称を付し、その遺伝子欠損株を作成したところシトクロムb6f/bc複合体の機能を低効率ではあるが補完し光合成による生育に働きうることが示された。本年度は特に、このET1複合体の細胞からの抽出と単離・精製に注力し、1%のドデシルマルトシドによる可溶化と主にイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いた分画によって高純度の標品を得ることに成功した。この標品を変性および未変性状態でゲル電気泳動解析（SDS-PAGEおよびBlue-Native PAGE）したところ、ET1複合体は遺伝子情報から推定された通り、約24 kDaのc型シトクロムと鉄-硫黄（FeS）タンパク質、およびキノール酸化能を持つ膜貫通タンパク質の３つから成る複合体であることが強く示唆された。このET1複合体やシトクロムb6f/bc複合体を経由して電子を光合成反応中心へ渡す水溶性電子伝達タンパク質の探索も行い、あまり純度は高くないものの、約10 kDaのc型シトクロムがその候補として精製された。N末端部のアミノ酸配列情報に基づき、このシトクロムcは亜酸化窒素（笑気ガス）の還元に働くNos酵素群の一員であることがわかった。これらのことは光合成や呼吸の電子伝達経路が単一かつ閉鎖的なものではなく、他の経路との重複を含めた複雑なネットワークとなっていることを示している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素（ET1）の精製は、タンパク質のN末端へヒスチジンタグを付加するように変異を加えたET1遺伝子を欠損株へ再導入し、その導入株菌体のディタージェント溶出物からNi-カラムにて高純度に精製する計画であったが、ET1複合体を構成する３つのサブユニットタンパクいずれにヒスチジンタグを付加してもNi-カラムへの吸着は見られなかった。そこでET1の精製はイオン交換カラムクロマトグラフィー等を組み合わせた従前の方法で行い、これによっても今後の解析実験に必要な収量と純度でET1複合体が得られたため、初年度の目標はほぼ達成できたと判断した。ただしET1を構成すると予想される３つのタンパク質の同定は別に行う必要がある。現状では、いずれのタンパク質もN末端アミノ酸が修飾されているようで、エドマン分解法などによる配列決定が困難な状況にあるため、マススペクトル解析など、異なる手段を用いる必要がある。
ET1の精製過程では、光化学反応中心を還元しうる別の水溶性シトクロムcの存在も新たに認められた。精製タンパク質のN末端アミノ酸配列解読に基づき、この新規シトクロムcの本来の役割は亜酸化窒素還元過程にあると予想された。当初は予想していなかった光合成電子伝達との関連を、今後は考慮に入れ研究計画に加えていく必要がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
基本的に当初計画に従って研究を推進する。新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素（ET1）が高収率・高純度に得られるようになったことにより、酸化還元滴定や時間分解分光測定が大きく進展することが期待される。平行して、構成するサブユニットタンパク質の同定のため、MALDI-TOFマススペクトル測定も行う。
光化学反応中心に対する電子供与体として新たに示唆された水溶性シトクロムcについて、精製光合成膜標品との再構成実験や欠損変異株の作成を通じて、光合成電子伝達への寄与をさらに明確にする。ET1からの電子受容の可能性についても明らかにする。
シトクロムbc1複合体とET1複合体の２重欠損株の培養実験から、これら以外にもキノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素が存在する可能性が示唆されているので、この第３の電子伝達タンパク複合体についても機能の確認と精製・同定を試みる。
以上の研究項目の推進により、光合成電子伝達ネットワークの全貌を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
当初予定した実験内容が一部変更されたことにより、使用予定の設備備品が初年度には購入不要となり、かつ消耗品購入が増大した。ただし実験目的はほぼ予定通り達成しているので、次年度繰越分は当該設備備品の購入に充当する予定である。
|
