2020 Fiscal Year Research-status Report
光合成電子伝達に必須なチトクロムbc複合体を機能相補する新規電子伝達酵素の同定
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18K06295
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| Research Institution | Kanagawa University |
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Principal Investigator |
永島 賢治 神奈川大学, 付置研究所, 研究員 (80264589)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 光合成電子伝達 / 紅色光合成細菌 / シトクロム / 遺伝子操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シトクロムbc1複合体（植物の葉緑体ではシトクロムb6fに相当）は、キノールの酸化および水溶性電子伝達タンパクの還元を行うとともに、これらと共役してプロトンの輸送を行う細胞膜結合タンパク質複合体であり、光合成や酸素呼吸の電子伝達鎖において必要不可欠な成分であると考えられてきた。本研究ではこのシトクロムbc1を機能相補する新規キノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素を探索し、その生理・生化学的機能を明らかにすることを目的としている。紅色光合成細菌においてこのような機能を果たすと推定された膜貫通タンパク質複合体にET1と仮称を付して精製し、ゲル電気泳動解析したところ、遺伝子情報から推定された通り、約24 kDaのc型シトクロムと38 kDaの鉄-硫黄（FeS）タンパク質、およびキノール酸化能を持つ42 kDaの膜貫通タンパク質の３つから成る複合体であることが示唆された。酸化還元滴定を行うと、中点電位が+194 mVおよび+358 mVの２種類のc 型ヘムが、およそ1:3の比で検出され、後者の成分は555 nmにα-吸収ピークを持つc型ヘムであることが確認された。これらのことは、ET1複合体がb6f/bc1複合体を機能相補しうることを強く裏付けている。このET1複合体とシトクロムbc1複合体の２重欠損株は光合成による生育が不可と思われたが、継代培養により光合成生育が回復したサプレッサー変異株が見いだされ、第３のキノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素の存在が予見された。これらのことは、光合成や呼吸の電子伝達経路が単一かつ閉鎖的なものではなく、他の代謝経路との重複を含む複雑なネットワークを形成していることを強く示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
紅色光合成細菌 Rubrivivax gelatinosus からの新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素複合体（ET1）の精製は、イオン交換カラムクロマトグラフィー等を適用した従前の方法でほぼ達成したと思われる。しかしこの複合体を構成する３つのサブユニットタンパク質の最終的な同定には至っていない。エドマン分解法に基づくアミノ酸配列決定法は、恐らく３つ全てでN末端が修飾されているために、解析不能であった。さらに、これら３つのタンパク質の推定アミノ酸配列に基づく抗体をそれぞれ作成し、免疫学的な検出（ウエスタン・ブロッティング）も試みたが、抗体の基質特異性が思いのほか低く、有意な検出結果が得られなかった。シトクロムbc1複合体とET1の２重欠損株のサプレッサー変異株において新たに推定された第３のキノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素についても、ET1と同様に精製・同定を試み、c型シトクロムを含む候補タンパク質が得られた。膜標品を用いた時間分解分光測定では光照射による酸化還元反応も確認された。ただし、ET1の各サブユニットタンパク質と同様、N末端が修飾されているらしく、遺伝子の同定には至っていない。一方、分光測定の実験過程でキノールの輸送に働く新規タンパク質の関与を見出すなど、当初は予想していなかった発見があり、新たな研究項目として追加した。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的には、当初の計画に従って研究を進める。高収率・高純度に得られるようになった新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素（ET1）、および第3のキノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素について、主に分光測定により詳細な機能解明を進める。生化学同定も引き続き検討していくが、むしろゲノム解析データを精査して、候補タンパク遺伝子を網羅的に欠落させて機能変化を観察することで生理機能を明らかにしていく。具体的には硝酸呼吸（脱窒）に働くc型シトクロム遺伝子norCやnosC、およびDMSO還元酵素遺伝子dmsABCなどについて欠損株の作製と光合成培養実験を進める。これらの膜結合型電子伝達タンパクから電子を受け取り、光化学反応中心に対する電子供与体として働く水溶性シトクロムcの同定も、精製光合成膜標品との再構成実験や欠損変異株の作成を通じてさらに明確にする。また、光化学反応中心からキノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素に至るキノールの輸送過程で働く新規タンパク質の生化学的性質や、詳細な反応機構も可能な限り追求する。以上の研究項目の推進により、紅色光合成細菌における光合成電子伝達ネットワークの全貌を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初予定した実験の内容を一部変更し遅延が生じたこと、および新型コロナウイルス蔓延と関連してディスポーザルのバイアル瓶やピペットチップなど基礎的な実験消耗品の納入が大幅に遅延またはキャンセルされたことにより繰り越しが発生した。当初は2020年度が最終年度であった本研究を1年間延長し、生じた次年度繰越分を、必要な消耗品の購入や論文の校閲・投稿用に充当し研究計画を完了させる予定である。
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