2019 Fiscal Year Research-status Report

超高感度酵素アッセイシステムの構築を目指した新規脂質ナノ粒子発光デバイスの開発

Research Project

Project/Area Number	18K06612
Research Institution	Kyoto Pharmaceutical University
Principal Investigator	武上茂彦京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (70298686)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	脂質ナノ粒子 / イクオリン / グルタチオン / γ-グルタミルトランスフェラーゼ / 生物発光
Outline of Annual Research Achievements	本申請課題は、革新的な酵素アッセイシステムを構築するために、粒子の表面を酵素－基質の特異的反応の場として提供し、感度と特異性に優れた新規な脂質ナノ粒子発光デバイス（LNPLD）を開発することを目的としている。初年度（平成30年度）は、グルタチオン（GSH）をモデル基質として選び、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）アッセイを可能とするLNPLDの粒子設計をおこなった。今年度（令和1年度）は、前年度に設計したGSHを粒子表面に修飾したLNPLD（GSH-LNPLD）を用い、γ-GT量が定量できるかを検討した。GSH-LNPLD懸濁液はUV照射後に白色から青色へと視覚的に変化した。このことから、GSHをLNPLD表面に修飾してもGSHは脂質間の重合を妨害することなく、GSH-LNPLDを調製できることが示された。GSH-LNPLDでは、γ-GT溶液を添加するとGSH-LNPLD中に封入しているイクオリン（AQ）の発光が観測された。これは、粒子表面のGSHにγ-GTが反応し、その結果としてAQが発光したと考えられた。加えて、γ-GTの濃度依存性も観測され、0.1～0.4 Uのγ-GT量の範囲においてAQの発光強度との間で直線性が認められた。一方、GSHを修飾していないLNPLDではγ-GTを添加してもAQの発光はほとんど観測されず、かつγ-GT量が増加してもAQの発光強度は増加しなかった。これらの結果から、GSHはLNPLDの表面に修飾されていること、およびGSH-LNPLDはγ-GTの検出に適用できる可能性を有することが示された。今後は、GSH-LNPLDの安定性とγ-GTに対する応答性の向上を目指し研究を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 脂質ナノ粒子発光デバイス（LNPLD）中に封入しているイクオリンの安定性を保持しつつ、グルタチオン（GSH）をLNPLDの脂質膜表面に修飾することに時間を要した。緩衝液中にカルシウムイオンが存在するとイクオリンと反応するため、当初、緩衝液中にEDTAを含有させ、カルシウムによるイクオリンの失活を防ぐことを試みた。しかし、EDTA含有緩衝液中では、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）のLNPLDに対する応答性が低かったため、EDTA含有緩衝液の使用を取りやめた。現在は、ウシ血清アルブミンとイクオリンを混合することにより、イクオリンの安定性が若干改善されたため、この調製法でLNPLDを作製し、データを取得中である。
Strategy for Future Research Activity	現在のグルタチオン修飾脂質ナノ粒子発光デバイス（GSH-LNPLD）では、γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）の定量域は、0.1～0.4 Uであり、臨床現場において使用するには感度が不足している。これは、GSHがLNPLDに仮定している量よりもかなり少ない量しか修飾できていない可能性が考えられる。したがって、今後は、感度をより向上させるべく、GSHの効果的なLNPLDへの修飾方法の検討、およびGSHがLNPLDに修飾されているかについて、ゼータ電位計等を用いて評価していく予定である。
Causes of Carryover	（理由）研究に必要な試薬等を購入していった結果、残金が2,638円となった。この金額では新たに試薬等を購入するのは不足なので、残金を次年度に繰り越し有効に利用したい。また、台風や新型コロナウィルスの影響により学会が中止となったため、旅費配当分を物品費に充てた。（使用計画）翌年度配当額である1,202,638円の内訳として、物品費　1,152,638円、国内旅費　50,000円を計画している。