2018 Fiscal Year Research-status Report
膵がんにおけるArl4cとIQGAP1の相互作用を介した細胞増殖制御機構の解析
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18K06956
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松本 真司 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20572324)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Wnt / Arl4c / IQGAP1 / 膵がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、「Arl4cによるIQGAP1との相互作用を介した新規の膵がん細胞の増殖制御機構」を明らかにすることを目的とし、2018年度は以下の研究成果を得た。
(1）膵がん細胞株S2CP8において、Arl4cを発現抑制したところ、免疫染色にて細胞膜上に局在するIQGAP1が減少した。この結果から、IQGAP1はArl4c依存的に細胞膜に局在することが明らかになった。
(2）IQGAP1がスキャフォールドとして制御することが報告されているRas/MAPキナーゼ経路活性化を膵がん細胞において評価した。S2CP8細胞においてTR-FRET（HTRF 法）を用いてERKのリン酸化を定量的に評価したところ、Arl4cとIQGAP1の発現抑制でいずれも10%程度のERKリン酸化の減弱が認められた。これらの結果から、Rasに変異を有する膵がん細胞において、Arl4cおよびIQGAP1はERKの活性化に一部関与するものの、寄与の程度は小さいことが明らかになった。
(3）IQGAP1は、CHD、IR、WW、IQ、GRD、RGCTの６つのドメイン構造を有している。各ドメイン毎の変異体IQGAP1を作製し、Arl4c結合ドメインを免疫沈降アッセイにて検討したところ、Arl4cはIQGAP1のCHDおよびRGCTドメインの2つの領域と相互作用することが明らかになった。CHDおよびRGCTを単独で欠失したIQGAP1変異体を作製したところ、それはいずれもArl4cとの結合能を有することが明らかになった。
(4）私どもは、マウスへの皮下投与によって肝腫瘍におけるArl4cの発現と腫瘍形成を抑制できるAmNA修飾型アンチセンス核酸（Arl4c-ASO）をすでに作製している。Arl4c-ASOはin vitroにおいて膵がん細胞のスフェア形成能と浸潤能を強く抑制した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画「Arl4cとIQGAP1の細胞内局在の相互依存性の解析」については、研究実績概要に記載したとおり、おおむね終了している。また、「IQGAP1のArl4c結合ドメインの同定とArl4c-IQGAP1相互作用の機能的意義の解析」についても結合ドメインの決定に成功しており、おおむね順調に進展していると判断した。
一方で、「Arl4cとIQGAP1によるERK活性化を介する細胞増殖制御機構の解析」については、Arl4cとIQGAP1ともに膵がん細胞においてERKの活性化に関与するものの、発現抑制による表現型が弱く、Arl4c-IQGAP1による膵がん細胞の増殖制御機構にはERK以外のシグナルも関与する可能性が示唆されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はArl4cがIQGAP1との相互作用を介して膵がん細胞細胞の増殖を制御するシグナル機構について、ERK経路以外にも検討する。IQGAP1はPI3K-AKTシグナルのスキャフォールドとしても機能することが報告されている。そこで、Arl4cとIQGAP1の発現抑制が膵がん細胞のAKTシグナルに与える影響を、AKT、mTOR、S6Kのリン酸化を指標に検討する。Arl4c-IQGAP1シグナルの膵がんにおけるin vivoでの機能解析には、すでに私どもが肝腫瘍において抗腫瘍効果を確認しているArl4cを標的にしたAmNA修飾型アンチセンス核酸（Arl4c-ASO）を用いる。In vitroでの膵がん細胞に対する抗腫瘍効果は既に確認しているので、今後は膵がん細胞の膵同所移植モデルに対してArl4c-ASOを投与し、原発腫瘍と所属リンパ節や肝臓への転移に与える影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
既に作製していた実験試料と入手済の物品を使用して、「Arl4cとIQGAP1の細胞内局在の相互依存性の解析」および「Arl4cとIQGAP1によるERK活性化を介する細胞増殖制御機構の解析」を行ったため、2018年度の使用額が予定よりも少なくなった。
一方で、次年度以降は「Arl4c-IQGAP1シグナルの膵がんにおけるin vivoでの機能解析」および、当初予定していなかった「Arl4cとIQGAP1によるERK非依存性経路を介する細胞増殖制御機構の解析」を行う予定であり、新たな細胞生物学実験試薬やマウスの購入等を予定している。
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